ICS 07. 100. 30 C 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19915.6—2005 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法 Method of the real-time PCR for the detection of Streptococcus suis 2005-09-27发布 2005-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19915.6—2005 前言 本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国兽医药品监察所 本标准主要起草人：张鹤晓、宋立、高志强、宁宜宝、周琦、乔彩霞、杨承槐、吴丹、谷强。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T19915.6—2005 猪源链球菌通用荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪源链球菌通用荧光PCR检测方法。 本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪源链球菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3缩略语 本标准采用下列缩略语： 荧光PCR荧光聚合酶链式反应 Ct 值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数 DNA 脱氧核糖核酸 TaqDNA聚合酶 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 4原理 采用TaqMan方法，在比对猪源链球菌16SrDNA基因序列的基础上，设计针对该基因的特异性引 物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示）， 3端标记TAMRA荧光素为率灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基团发出的荧光 信号。PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧 光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5→3'的外切核 酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接 收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 5猪源链球菌通用荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理 猪源链球菌通用荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C。 6试剂和材料 6.1试剂 除另有说明，所用试剂均为分析纯。 6.1.1无水乙醇：一20℃预冷。 6.1.275%乙醇：用新开启的无水乙醇和无DNA酶的灭菌纯化水配制，一20℃预冷 6.1.30.01mol/LpH7.2的PBS：配方见附录A，（121土2）℃、15min高压灭菌冷却。 1 GB/T19915.6—2005 6.1.4猪源链球菌通用荧光PCR检测试剂盒！：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B。 6.2仪器设备 6.2.1高速台式冷冻离心机：最大转速13000r/min以上。 6.2.2荧光PCR检测仪、计算机。 6.2.32℃~8℃冰箱和-20℃冰箱 6.2.5组织匀浆器。 6.2.6混匀器。 7样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 7.1取样工具 7.1.1棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendorf管。 7.1.2所有上述取样工具应经（121士2）℃、15min高压灭菌并烘干或经160℃干烤2h。 7.2采样方法 7.2.1生猪拭子样品 咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上聘来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。 7.2.2扁桃体、内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mLPBS混匀，然后将组织 悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用。 7.2.3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。 7.3存放与运送 采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置一70℃冰箱，但应 避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实 验室。 8操作方法 8.1样本核酸的提取 在样本处理区进行。 8.1.1提取方法1 8.1.1.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和，对每个管进行编号标记。 8.1.1.2每管加入1.0mL裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照和阳性对照各100μL，一份样本 换用一个吸头，混匀器上震荡混匀5s，于4℃～25℃条件下，10000r/min离心10min。 8.1.1.3取与8.1.1.1中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加入500μL无水乙醇（-20℃预 不要吸出底部沉淀，颠倒混匀。 8.1.1.4于4℃~25℃条件下，5000r/min离心5min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放 置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入1.0mL 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T19915.6—2005 75%乙醇，颠倒洗涤。 8.1.1.5于4℃~25℃条件下，5000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放 置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。 8.1.1.64000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份 样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5s～15s。不宜过于干燥，以免DNA不溶。 8.1.1.7加入11μL无DNA酶的灭菌纯化水，轻轻混匀，溶解管壁上的DNA,2000r/min离心5s， 冰上保存备用。 8.1.2提取方法2 8.1.2.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和，对每个管进行编号标记 份样本换用一个吸头，混匀器上震荡混匀5s，于4℃～25℃条件下，13000r/min离心10min。 8.1.2.3尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加人10μLDNA提取液2，混匀器上震荡混匀5s。于4℃~ 25℃条件下，2000r/min离心10s。 8.1.2.4100℃干浴或沸水浴10min；加入40μL无DNA酶的灭菌纯化水，13000r/min离心10min， 上清即为提取的DNA，冰上保存备用。 8.1.3DNA提取后的处理要求 提取的DNA须在2h内进行PCR扩增或放置于一70℃冰箱。 8.2扩增试剂准备与配制 在反应混合物配制区进行。 从试剂盒中取出猪源链球菌通用荧光PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。 设所需PCR数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需 使用15μLPCR反应液及0.3μLTaq酶。计算各试剂的使用量，加人一适当体积试管中，向每个PCR 管中各分装15μL，转移至样本处理区。 8.3加样 在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入8.1.1.7或者8.1.2.4中制备的DNA溶液 10μL，使总体积达25μL。盖紧管盖后，500r/min离心30s。 8.4荧光PCR反应 在检测区进行。将8.3中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。 反应参数设置： 一第一阶段，预变性92℃3min； 一第二阶段，92℃5s，60℃30s，45个循环，荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进 行。 9结果判定 9.1结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可 根据仪器噪音情况进行调整。 9.2质控标准 9.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。 9.2.2阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。 9.2.3如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。 3