ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 186532002 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法 Methods for isolation and identification of campylobactor fetus 2002-02-19发布 2002-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 GB/T18653—2002 言 前 本标准是依据加拿大国家动物疾病研究所的实验室操作规程，结合本国实际情况制定的，通过大量 试验，证实该方法准确可靠。 本标准的附录A是标准的附录，附录B是提示的附录 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：天津动植物检疫局。 本标准主要起草人：秦贞奎、侯艳梅、张碧波 中华人民共和国国家标准 GB/T18653—2002 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法 Methods for isolation and identification of campylobactor fetus 1范围 本标准规定了胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法 本标准适用于牛、绵羊、冷冻精液胎儿弯曲杆菌的检验，其他动物可参照使用。 2胎儿弯曲杆菌的分离鉴定 2.1设备和材料 2.1.1混合气体［质量比为3.5%氧（O2）、10%二氧化碳（CO，）、86.5%氮（N2）]。 2.1.2厌氧培养罐。 2.1.3采样棒及吸球。 2.1.42mL注射器，5号针头，20号针头。 2.1.5灭菌青霉素瓶及生理盐水。 2.1.6供常规细菌分离鉴定用的基本设备与材料。 2.2培养基和试剂[见附录A（标准的附录）]。 2.2.1增菌运输培养基（TEM)。 2.2.2半胱氨酸牛心浸膏培养基（CH)。 2.2.3琼脂培养基（MH)。 2.2.4巯基乙酸盐肉汤。 2.2.5相关生化试剂。 2.3胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序见附录B（提示的附录）示意图 2.4分离培养 2.4.1样品采集 2.4.1.1母牛站立或六柱栏保定，用5%来苏儿消毒牛的外阴部，将采样棒的采样端插人阴道，压扁另 一端的吸球，并来回抽动，吸取阴道粘液。取出采样棒后，插入盛有3mL灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数 次，再将采样棒放消毒液中 的尿道口，将采样棒的采样端插人阴筒内，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取包皮液。取出采样棒迅 速插入盛有3mL灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次。 2.4.1.3样品液静置1min～2min，用灭菌注射器吸取上清液2mL，分别注人两瓶增菌运输培养基 （见附录A中A1)中，每瓶1mL。振荡混匀，尽快送至实验室。 2.4.1.4取样品做革兰氏染色并做湿涂片镜检。也可用棉拭子蘸取样品液直接涂布于含抗菌素的MH （见附录A中A3)或CH（见附录A中A2)琼脂平板上。 2.4.2已接种样品的增菌运输培养基置37C培养72h。用直径3mm的接种环将增菌液分别划线于 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准 2002-05-01实施 1 GB/T 18653—2002 人经0.22μm滤膜过滤的混合气体至负压为零，再将气体抽出和充入反复两次。将培养罐在37C培养 72h。以后胎儿弯曲杆菌均需在混合气体条件下培养。 2.4.3观察MH、CH培养基上有无疑为胎儿弯曲杆菌的菌落，如无可弃之。如有，将典型或可疑菌落 划线于MH或CH琼脂平板培养基上培养72h。 胎儿弯曲杆菌在MH或CH平板培养基上的菌落特征为：不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直 径为1mm左右。 2.5鉴定 2.5.1筛选试验 2.5.1.1取典型或可疑纯培养物做革兰氏染色、湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化氢酶试验（试剂 配方见附录A中A5、A6）。 胎儿弯曲杆菌为革兰氏染色阴性，呈螺旋状或“S”状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形 成芽胞和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征快速螺旋状穿梭运动。氧化酶试验为阳性。 2.5.1.2纯培养平板用后尽快放回混合气体环境中，以备进一步做生化试验用。 2.5.2生化试验 2.5.2.1将符合2.5.1.1条的培养物按表1进行生化试验。 表1胎儿弯曲杆菌生化反应 生长试验 药敏试验 硫化氢 马尿酸 过氧化氢 氧化酶 菌名 (H,S) 3.5%氯 萘啶酮 头孢霉素 钠水解 1%甘 1%胆 酶试验 试验 25℃ 试验 42C 氨酸 汁 化钠（NaCI） 酸30μg/片 30μg/片 试验 胎儿弯曲杆 R + 菌胎儿亚种 胎儿弯曲杆 R S 菌性病亚种 注：“+” 阳性反应； 阴性反应； “干” 反应不定； "R"- 拮抗； "S" 敏感。 2.5.2.2月 所有生化试验管均于混合气体环境中培养3d。带胶盖或螺旋盖的试管，培养时应将试管盖 放松。 2. 5. 2. 3 生长试验：纯培养后的菌接种到2管巯基乙酸肉汤（见附录A中A4)中，分别放43C和25C 温箱培养72h观察结果，肉汤上层出现雾状混浊时，说明细菌已生长。 2.5.2.4硫化氢（H,S)试验：纯培养后的可疑菌种接种于巯基乙酸肉汤中，试管口悬吊一条长X宽为 20mmX6mm的乙酸铅滤纸，观察3d～4d，如见滤纸变黑即为产生HzS之证。 2.5.2.5甘氨酸、氯化钠、胆汁生长试验：可疑菌种分别接种于含1%甘氨酸、3.5%氯化钠、1%胆汁生 长的巯基乙酸肉汤中，37C培养72h，培养基近表面有云雾状生长为阳性。 2.5.2.6药物敏感试验：用铂金耳挑取可疑菌落放于1mL灭菌生理盐水试管中，菌液浓度约为3× 和头孢霉素的滤纸片贴在MH血平板上，在混合气体中37C培养24h～72h，量溶菌区，Φ18mm为 敏感，<14mm为不敏感。 2 GB/T 18653—2002 2.5.2.7马尿酸钠水解试验：取48h～72h培养物接种于0.4mL1%马尿酸钠液（见附录A中A7.1) 中制成浓厚菌悬液35C~37C水浴2h，再加入0.2mL节三酮试剂（见附录A中A7.2），混匀后水浴 20min观察结果，变深紫色为阳性，淡紫色或不变色为阴性。可用18h～24h变形杆菌培养物作阳性 对照。 2. 5. 3 3结果判定 根据2.5.1和2.5.2的结果进行。 2.5.3.1凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特性的菌，均判定为胎儿弯曲杆菌。 中任何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性，均判定为非胎儿弯曲杆菌。 2.6报告结果的表示 2. 6. 1 阳性结果：“发现胎儿弯曲杆菌”“发现胎儿弯曲杆菌胎儿亚种”或“发现胎儿弯曲杆菌性病 亚种”。 2. 6. 2 阴性结果：“未发现胎儿弯曲杆菌”。