ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T186392002 狂犬病诊断技术 Diagnostic techniques for rabies in animals 2002-02-19发布 2002-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 GB/T18639—2002 前言 狂犬病（rabies）是由弹状病毒科狂犬病病毒引起的一种人兽共患的急性接触性传染病。主要侵害 中枢神经系统，引起狂暴不安和意识紊乱等症状，最后麻痹、衰竭而死。发病率不高，病死率几乎为百分 之百。本病呈世界性分布，以亚洲最多发生。我国也不例外，近年来有增多的趋势。世界各国十分重视 狂犬病的研究和检疫。世界动物卫生组织[WorldOrganizationforAnimalHealth（英），OfficeInten tionaldesEpizootic（法），OIE］和我国已将其列为重点防制的二类动物疾病。 狂犬病症状非常明显，却非十分特异，且无肉眼可见的特殊病变。狂犬病的确诊有赖于实验室的检 查结果。但是，由于本病发病急，病程短，病死率高，使得实验室诊断通常以检查病毒抗原为主。例如，世 准是参照WHO和OIE推荐的这些方法，结合我国的研究成果和实际情况而制定的。本标准的实施，对 提高狂犬病的诊断和检疫水平，及时采取防制措施，保证人畜健康，将起到重要作用。 需要指出的是，内基氏小体检查和免疫荧光试验分别可能产生5%～10%和2%5%的假阴性结 果。因此，在进行上述两项检查的同时，应进行小鼠感染试验，即把这三项检查视为狂犬病诊断的三个必 要程序。 本标准的附录A为标准的附录，附录B为提示的附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国人民解放军农牧大学。 本标准主要起草人：宣华、向华。 中华人民共和国国家标准 GB/T 18639—2002 狂犬病诊断技术 Diagnostic techniques for rabies in animals 1范围 本标准规定了狂犬病内基氏小体（negri bodies）检查、免疫荧光试验、小鼠和细胞培养物感染试验 的技术要求。 本标准适用于各种易感动物的狂犬病的诊断和检疫。 2内基氏小体检查 2.1准备 2.1.1器材：胶皮手套、口罩、防护眼镜等个人防护器具；骨锯、骨凿、骨剪、脑刀等动物解器具；切片 机、染色缸等组织制片与染色器具；光学显微镜等 2.1.2标本保存液：10%（体积分数）福尔马林溶液，50%（体积分数）甘油生理盐水。 2.1.3染色液：赛勒（Seller）氏染色液，曼（Mann）氏染色液，其配制方法见附录A（标准的附录）。 2.1.4人身防护：见附录B（提示的附录）。 2.2样品的采集和运送 2.2.1对可疑为狂犬病而扑杀或死亡的动物（含实验感染小鼠），应在死亡后3h内（越早越好）由大脑 海马回（Ammon氏角）、小脑皮质和延髓各切取1cm组织数块，放入灭菌玻璃瓶，再置于冰瓶内于24h 内送达实验室。 2.2.2不能立即送检者，应加10%福尔马林溶液固定，或加50%甘油生理盐水，4C保存送检。 2.3标本片的制备 2.3.1对新鲜脑组织，可用外科刀切开，以通过火焰去脂的载玻片在其切面上触压一下制成压印片。每 张载玻片可接触2~3个部位，每份材料做3～4张。 2.3.2在甘油盐水中保存的新鲜病料，应先用生理盐水彻底洗去甘油，方可制片，制片方法同2.3.1。 2.3.3所有压印片于室温下干燥后，浸人甲醇溶液固定2min。 2.3.4经10%福尔马林溶液充分固定过的脑组织可按常规方法制备组织学切片。 2.4染色 2.4.1赛勒氏染色法 在经过甲醇固定并风干的压印片上，滴加赛勒氏染色液（以盖满压印面而不溢为度）着染5S~ 10s，然后用蒸馏水冲洗，干燥后镜检。 2.4.2曼氏染色法 2.4.2.1将经过甲醇固定并风干的压印片，或者经过脱蜡、浸水、风干的切片浸人曼氏染色液中浸染。 压印片浸染5min，切片浸染时间因温度而异（室温下24h，或38C温箱中12h，或60C温箱中2h）。 2.4.2.2以蒸馏水快速洗去染色液，至无浮色出现为止，用吸水纸吸干。 2.4.2.3以无水乙醇稍洗，至标本区刚出现蓝色为度 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准 2002-05-01实施 1 GB/T18639—2002 2.4.2.4浸人碱性乙醇分化15s～20s，至标本区出现红色。 2.4.2.5依次通过无水乙醇和蒸馏水各数秒钟，分别洗去氢氧化钠和乙醇，再浸入微酸性水中1min 2min。酸化期间，经常于显微镜下观察，至细胞核出现蓝色为宜；如果核蓝色过深，说明酸化过度，可 退回至碱性乙醇，再作短时分化。 2.4.2.6以蒸馏水水洗后，依次通过95%乙醇和无水乙醇脱水，并经二甲苯透明，最后加香胶封固。 2.5显微镜检查及判定 通常含有一个内基氏小体，但也可含有几个。用赛勒氏染色时，内基氏小体呈桃红色，神经细胞为蓝紫 色，组织细胞为深蓝色。用曼氏染色时，内基氏小体为鲜红色，神经细胞的胞核为蓝色、胞浆为淡蓝色，红 细胞为粉红色。有时，在鲜红色的内基氏小体中还可以见到嗜碱性的蓝色小颗粒。 内基氏小体即狂犬病包涵体，为狂犬病所特有。因此，一旦检出内基氏小体，即可确诊。但在检查犬 脑时，应注意与犬瘟热病毒引起的包涵体相区别。犬瘟热包涵体主要出现于呼吸道、膀胱、肾孟、胆囊、胆 原内很少见到。 3免疫荧光试验 SAG 3.1材料准备 3.1.1器材 荧光显微镜，恒温箱，载玻片（片厚2mm以下），盖玻片，冰冻切片机。 3.1.2试剂 3.1.2.1异硫氰酸荧光黄（FITC)标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白（以下简称狂犬病荧光抗体）和未标记 （Evansblue）染色液稀释成2～4个染色单位。例如，荧光抗体染色效价为1：64，则作1：32～1：8稀 释后使用。 3.1.2.2丙酮（分析纯）使用前置普通冰箱内预冷至4C左右 3.1.2.30.01 mol/LpH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBSS)。 3.1.2.40.02%伊文思蓝染色液。 3.2样品的采取和运送 同 2. 2。 3.3标本片的制备 3.3.1病料标本片制备 3.3.1.1按照2.3的方法和要求制得压印片，也可由切面刮取脑细胞泥均匀涂成直径约1cm的圆形 涂抹面，或者参照常规方法将被检脑组织制成厚度在5μm～8um的冰冻切片。 3.3.1.2标本片于空气中自然干燥，在冷丙酮中固定4h或过夜，然后在冷磷酸盐缓冲盐水中轻轻漂 3.3.2细胞培养物标本片制备 接种了被检病料的细胞培养物（如神经母细胞瘤细胞），继续在二氧化碳恒温箱中培养48h，随后 用橡皮刮子刮取细胞泥在载玻片上制成薄而均匀涂片。当以盖玻片为载体生长的细胞培养物时，则可直 接取此长满细胞单层的盖玻片作为标本片。然后按3.3.1.2风干、固定和保存。 3.4染色 3.4.1用吸管吸取稀释的狂犬病荧光抗体，滴加1～2滴于经丙酮固定的标本片上，使其布满整个标本 区。 3.4.2将标本片置于塘瓷盘内（盘底垫以浸湿的纱布，纱布上放玻片架），放37C恒温箱内着染 2 GB/T18639—2002 30 min。 酸盐缓冲盐水，每缸浸泡3min，并不时轻轻振荡。最后在蒸馏水中浸泡3min。 3.4.4在吸水纸上轻轻磕尽玻片上的蒸馏水，自然干燥后，于标本区上滴加1滴甘油缓冲液（分析纯中 性甘油9份，pH7.4磷酸盐缓冲盐水11份），覆盖玻片扣于载玻片上，然后镜检。 3.5对照设置 3.5.1已知狂犬病病毒标本片加狂犬病荧光抗体染色应有特异荧光出现， 3.5.2已知狂犬病病毒标本加狂犬病未标记抗体阻抑后，再加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出 现。 3.5.3已知狂犬病病毒阴性标本片加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现 3.6荧光显微镜检查及判定 一般用蓝紫光，激发滤光片用BG12，吸收滤光片用OGi或GGg，以满足异硫氰酸荧光黄的荧光谱要 求为准。暗视野聚光器比明视野聚光器易于观察特异性荧光。物镜浸油须用无荧光镜油，也可以封片用 的甘油缓冲液代替。先检查对照标本。只有在对照标本的染色结果符合3.5.1～3.5.3要求时才能去检 查被检标本。特异性荧光呈亮绿至黄绿色，背景细胞染成淡黄或橙红色，细胞核成暗红色。狂犬病特异 性荧光颗粒较大，数量不等，位于细胞浆内。凡在神经细胞胞浆内发现特异性荧光，均应判为狂犬病病毒 感染者。 4小鼠和细胞培养物感染试验 4.1材料准备 4.1.1器材：细胞培养瓶（或管），二氧化碳恒温箱，微量超滤器（滤膜孔径0.45μum），微量组织研磨器， 普通离心机及离心管，0.25mL注射器及针头等。 4.1.2试剂：0.5%水解乳蛋白汉克氏（Hanks）液，伊格尔氏（Eagle）最低要素培养液（EMEM），特牛血 清，20000IU/mL青霉素溶液，20000μg/mL链霉素溶液等。 4.1.3小鼠：无特定病原（SPF）易感小鼠，5～7日龄（也可用3～4周龄者，但发病时间可能稍推迟）。 4.1.4仓鼠肾传代细胞（BHK2i）或小鼠神经母细胞瘤（NAC1300）细胞。 4.2样品的采取和运送 除可按照2.2的方法和要求送检新鲜脑组织外，还应采集唾液送检。方法是：用灭菌吸管吸取或用 低温保存备用。 4.3样品的处理 脑组织用组织研磨器磨碎，加0.5%水解乳蛋白Hanks液制成20%（m/V）混悬液，以3000r/min 离心30min，吸取上清液，加人青霉素500IU/mL和链霉素500μg/mL，在4C处理3h～4h，即可