ICS 07.080 CCS A 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 38485—2021 微生物痕量基因残留测定 微滴数字PCR法 Determination for trace gene residues of microorganisms- Microdroplet digital PCR 2022-07-01实施 2021-12-31发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38485—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由中国标准化研究院提出并归口。 究院 1 GB/T 38485—2021 微生物痕量基因残留测定 微滴数字PCR法 1范围 本文件规定了用微滴数字PCR法测定微生物痕量基因残留（100pg/mL以下）的方法。 本文件适用于加工产品中酿酒酵母和植物乳杆菌痕量特征基因残留（100pg/mL以下）的测定 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 痕量基因残留 trace gene residue 微生物加工产品在后续分离纯化中很难去除的痕量（含量在100Pg/mL以下）核酸。 4原理 利用液滴微流控技术，将待测生物样品所残留的目标核酸PCR扩增体系分割成几十份到几万份包 含一个拷贝的核酸分子微升级油包水微滴。按照常规PCR体系对其进行扩增，通过荧光探针实现信号 读出。所产生微滴阳性信号的数目即代表了原始样本中目标核酸分子的拷贝数，从而直接数出目标核 酸分子的个数，对起始样品的痕量基因残留进行定量。 5 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1水为GB/T6682规定的一级水。将一级水在121℃下高压加热灭菌15min制备得到无菌水。 5.2DNA提取试剂盒。 5.3微滴数字PCR反应试剂盒。 5.4引物和探针 5.4.1酿酒酵母引物和探针： SC-F:5'-GGACTCTGGACATGCAAGAT-3'; SC-R:5'-ATACCCTTCTTAACACCTGG-3'; SC-P:5'-FAM-CCCTTCAGAGCGTTTTCTCTAAATTGATAC-BHQ1-3'。 1 GB/T38485—2021 5.4.2植物乳杆菌引物和探针： Lp-F:5'-TTACATTTGAGTGAGTGGCGAACT-3'; Lp-R:5'-AGGTGTTATCCCCCGCTTCT-3' Lp-P:5'-FAM-CAGGTTWCCCACGTGTTACTCAC-BHQ1-3。 5.5酵母浸出粉陈葡萄糖培养基（YPD培养基）：称取蛋白陈20.0g，酵母提取物10.0g，葡萄糖20.0g， 热灭菌15min。 5.6乳酸细菌培养基（MRS培养基）：称取蛋白陈10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠 檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，加人吐温-801.0mL，先加 人990mL水溶解，并调节pH至6.2～6.6的范围内，再定容至1000mL。然后在121℃下高压加热 灭菌15min。 液。取种子液0.5mL转接于10mLYPD液体培养基中，在恒温震荡摇床中以30℃土1℃和 180r/min的条件培养至OD600为0.3～0.4（约2h～~3h），得到酿酒酵母ATCC204508纯培养物 5.8植物乳杆菌CGMCC1.2437纯培养物：挑取活化平板中植物乳杆菌CGMCC1.2437的单菌落 接种至25mLMRS液体培养基中，在恒温震荡摇床中以30℃土1℃和180r/min的条件培养过夜 得到种子液。取种子液0.5mL转接于10mLMRS液体培养基中，在恒温震荡摇床中以30℃士 1℃和180r/min的条件培养至OD6为0.3~0.4（约2h～3h），得到植物乳杆菌CGMCC1.2437纯 培养物。 6仪器设备 6.1微滴数字PCR仪。 6.2核酸定量仪。 6.3热循环仪。 6.4电子天平：精度0.01g。 6.5移液器：量程0.1μL～2.5μL，2μL~20μL,10μ~100μ和100μL~1000μL。 6.6 恒温震荡摇床：温度可实现（28±1）℃和（37土1）℃，转速在125r/min～250r/min。 6.7F pH计：精度0.1。 6.8 紫外-可见光分光光度计：可检测波长包含（600士20）nm，配备1cm比色皿。 7反应体系准备 7.1酿酒酵母残留基因检测反应体系的准备 7.1.1受试样品DNA模板准备 取1.00g受试样品，按照核酸提取试剂盒说明书进行DNA提取操作，最后使用50uL的无菌进行 DNA洗脱。提取得到的DNA样品使用核酸定量仪检测核酸的浓度和纯度 7.1.2阳性对照DNA模板准备 取植物乳杆菌纯培养物（5.8）100μL，用无菌水稀释至OD60a为0.2（此时菌体浓度约为2×108 CFU/mL）。采用梯度稀释的方法，继续用无菌水稀释至菌体浓度为1X10"CFU/mL。取100μL稀释