ICS 07.080 CCS C 04 团体 标准 T/CI 121—2023 RNA定量测序技术规程 The technical procedure of RNA quantitative sequencing 2023 - 08 - 31发布 2023 - 08 - 31实施 中国国际科技促进会 发布 全国团体标准信息平台 T/CI 121 —2023 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 缩略语 ................................ ................................ ............. 1 5 质量控制要求 ................................ ................................ ....... 2 6 RNA核酸样品采集方法 ................................ ................................ 3 7 总RNA核酸样品完整度检测 ................................ ........................... 4 8 RNA建库 ................................ ................................ ............ 5 9 高通量测序仪质控及测序 ................................ ............................ 12 10 数据分析 ................................ ................................ ......... 12 全国团体标准信息平台 T/CI 121 —2023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中 国国际科技促进会提出并归口。 本文件起草单位：深圳承启生物科技有限公司、武汉承启医学检验实验室有限公司、暨南大学、华 南理工大学、赛哲生物。 本文件主要起草人： 张 弓、陈 洋、 余 卓、 王 鑫、卢少华、 金静洁、 杜红丽 、卢 红、陈 杰。 全国团体标准信息平台 T/CI 121 —2023 1 RNA定量测序技术规程 1 范围 本文件确立了用于高通量转录组测序的总 RNA核酸类样品的转录组测序和质控全流程，包括样本 采集、处理、运输、检测和数据产生和质量评估分析全流程。 本文件适用于从新鲜动植物组织、新鲜可培养细胞、全血和细菌 /真菌等样品 中提取的真核生物和 原核生物的总 RNA样本的测序。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 35537 -2017 高通量基因测序结果评价要求 GB/T 40664-2021 用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求 T/CHIA 21.4 -2021 组学样本处理与数据分析标准 第4部分：转录组文库构建 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 高通量基因测序 high-throughput gene sequencing 区别于传统双脱氧（ Sanger）测序，一种能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术， 通常一次测序反应能产出不低于 100 Mb的测序数据。 [来源：GB/T 30989-2014，3.19] 3.2 转录组定量测序 whole transcriptome quantitative sequencing 是通过新一代测序技术全面测定 某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列， 通过对序列的统计分 析确定每种转录本的量 。 3.3 文库 library 通过生物来源的、人工合成的或克隆技术等所得到的一个重建分子群，如基因组文库、互补 DNA文 库、噬菌体展示肽文库等。 [来源：GB/T 30989-2014，3.5] 3.4 测序片段 reads 高通量测序平台产生的含有碱基序列和质量值的序列片段。 [来源：GB/T 35890-2018，3.2] 3.5 Q30 测序数据 中，碱基识别质量值为 30的碱基识别准确率为 99.9%，或错误率为 0.1%。 [来源：GB/T 40226-2021，3.6] 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RNA：核糖核苷酸（ Ribonucleic acid） 全国团体标准信息平台 T/CI 121 —2023 2 DNA：脱氧核糖核苷酸 （DeoxyriboNucleic acid ） rRNA：核糖体 RNA（Ribosomal RNA ） bp：碱基对（ Base pair） OD：光密度 （Optical density ） Trizol：总RNA抽提试剂（ TRIpure Reagent ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ） DNB：DNB纳米球（DNA nanoball ） NCBI：美国国家生物技术信息中心（ National Center for Biotechnology Information ） RefSeq：RNA参考序列库（RNA reference sequences collection ） FANSe3：超高精度的高速序列比对算法（ Fast and Accurate mapping algorithm for Next-generation Sequencing, the 3rd generation ） 5 质量控制要求 通用要求 5.1 5.1.1 生物样本及相关数据的使用应遵守区域、国家和国际的伦理规范。 5.1.2 样本质量要求应通过完整性和样本浓度确定，达到 GB/T 40664-2021的总RNA样品质量要求。 5.1.3 用于高通量测序的核酸类样本应根据 GB/T 35537 -2017中4.1和4.2中的碱基测序准确率的要 求进行质量控制。 5.1.4 使用MHCC97H细胞来源的 RNA标准品进行转录组测序，对测序仪状态进行评估： 按测序仪推荐 的上样量进行测序， 测序采用 PE150模式进行，对第一端数据进行分析，使用 FANSe3将reads比对到 NCBI refseq 人类标准参考转录组， FANSe3设置参数为 -E5 -I1，比对率＞80%，Q30＞80%，说明仪器和 试剂状态良好，可进行待测样品的转录组高通量测序。 5.1.5 所有使用的化学试剂均要求至少分析纯。 动植物组织、培养细胞、全血和细菌 /真菌样本量要求 5.2 根据不同样品类 型和不同测序目标准备足量样品，在条件许可情况下，尽量加倍准备样品量，并做 好样品备份工作，表 1为推荐样品量 。 表1 推荐样品量 样品类型 推荐样品量 新鲜动物组织 200 mg 新鲜植物组织 300 mg 新鲜培养细胞 3×106 个 全血 1 mL 细菌/真菌菌体 300 mg RNA样品运输要求 5.3 5.3.1 RNA样品如果需要运输， 应尽量溶于足量 Trizol后运送（ Trizol的体积应不小于 RNA溶液体积 的5倍，并充分混合均匀）， 尽量送往距离最近的实验室进行后续实验操作 。 5.3.2 如需低温运送， 应使用足够多的冰袋和保温盒，保证整个运输过程中的温度。低温运送时不应 使用干冰。 5.3.3 空运时可使用普通 0°C冰袋或-20°C封闭式冰盒，以防止温度过低而使塑料管变脆破裂。应使 用旋盖密封管或气密性包装， 以免因气压变化造成管盖弹开。 5.3.4 不同运送距离和时间，推荐运输条件见表 2。 全国团体标准信息平台 T/CI 121 —2023 3 表2 RNA样品推荐运输条件 距离 到达时间 建议运输条件 小于200公