ICS65.020.20 CCSB15/19 TBXH 新疆维吾尔自治区植物保护学会团体标准 T/ZBXH 123—2025 蝗虫微孢子虫Real-time PCR检测技术规范 Technicalspecificationfor detection of paranosemalocustaeby Real-time PCR 2025- 09- 20 发布 2025 - 09 -27 实施 新疆维吾尔自治区植物保护学会 发 布 全国团体标准信息平台 IIT/ZBXH 123 —2025 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件中某些内容可能涉及相关知识产权保护内容，本文件的发布机构不承担相关识别等责任。 本文件由新疆师范大学提出。 本文件由新疆维吾尔自治区植物保护学会归口。 本文件起草单位：新疆师范大学、新疆维吾尔自治区草原生物灾害防控中心、察布查尔县农业农村 局。 本文件主要起草人：扈鸿霞、康晗晔、杨坤、吴建国、樊泰山、季荣、林峻。 本文件适用于新疆维吾尔自治区内所有相关单位及组织， 自愿采用。 本文件由采用本标准的单位及组织自行承担相关责任。 本文件由新疆维吾尔自治区植物保护学会负责解释。 本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆师范大学。 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 123 —2025 4蝗虫微孢子虫 Real-time PCR 检测技术规范 1 范围 本文件规定了蝗虫微孢子虫（ Paranosema locustae ）TaqMan实时荧光定量 PCR检测方法。 本文件适用于蝗虫及蝗虫组织中微孢子虫的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 TaqMan探针TaqMan Probe 一种双标记荧光寡核苷酸探针，其序列与 PCR扩增的靶 DNA片段互补。 3.2 实时荧光定量 PCR quantitative real-time PCR 在体外扩增微量 DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光物质的释放或荧光物质与扩增产物结合 而释放荧光信号，通过对荧光信号积累的实时监测来实现对起始模板中的靶标 DNA的定量分析。 3.3 16S ribosomalRNA 基因16S ribosomalRNA gene 在此标准中指蝗虫微孢子虫（详见附录 A）的小亚基核糖体 rRNA(ribosomal RNA ，16S)基因， 详见附录 B.1。 3.4 Ct值cycle threshold 每个管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 探针法荧光定量 PCR是一种在 PCR反应中实时监测扩增产物量的技术。其核心原理在于利用一种 特异性荧光标记的探针 -TaqMan 探针。本规范利用荧光信号随着目的 PCR产物的增加而增强的原理， 统计PCR扩增过程的荧光信号值，最后根据 Ct值来判断样品中是否含有蝗虫微孢子虫。该探针 5`端标 记6-FAM，3`端标记MGB，当探针完整时， MGB有效淬灭 FAM的荧光，无信号。当探针被水解后， FAM与MGB分离，MGB的淬灭作用消失， FAM便可自由地发出可检测的绿色荧光。详见附录 B.2。 5 荧光定量PCR 检测 本规范根据蝗虫微孢子虫的 16S rRNA 基因的保守序列设计特异性引物进行 PCR扩增反应，统计 P CR扩增过程的荧光信号值，最后根据 Ct值来判断样品中是否含有蝗虫微孢子虫。在 PCR扩增的退火 / 延伸阶段， Taq酶发挥5’→3’外切核酸酶活性，将探针水解切割，使两个基团分离。一旦分离， R基 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 123 —2025 4团的荧光信号便得以释放。每扩增一条 DNA链，就有一个探针被水解，释放一个荧光信号。因此，荧 光信号的强度与 PCR产物的数量成正比。通过实时监测荧光强度的变化，即可精确地对起始模板 DNA 进行定量分析。详见附录 C、D。 6 结果判定 6.1蝗虫微孢子虫拷贝数与荧光定量 Ct值的关系： Y=-0.2665X+11.712 相关系数 R²=0.9994 。 （X：荧光定量 Ct值；Y：蝗虫微孢子虫拷贝数）。详见附录 E。 6.2每一次检测都加入阴性和阳性样品做对照，在 PCR反应体系正常工作的情况下，根据收集的荧光 曲线和Ct值判定结果，判定规则如下： ——待测样品检测 Ct值小于或等于阳性对照的 Ct值，判定该样品检出蝗虫微孢子虫。 —— 待测样品检测 Ct值大于或等于阴性对照的 Ct值，判定该样品未检出蝗虫微孢子虫。 6.3检测数据整理，详见附录 F。 6.4档案管理： qPCR检测的原始数据、引物探针序列、标准品信息、质控记录等单独归档。 7 样品的运输与采集 7.1样品采集 在研究区域设置样地，每个样地内设三条间隔 10 m样线，采样人员沿着每条样线进行扫网，左右 各挥动180°为一复网，每条样线扫 50复网，每个样地共 150复网，对网内蝗虫种类、数量和龄期相 关 数据记录和统计。使用 50 mL离心管或广口瓶保存，无水乙醇体积需完全浸没所有蝗虫样本，且液 面高出样本顶部 1 cm～2 cm。 7.2样品贮运与保存 采集的蝗虫样品用无水乙醇固定的可用离心管分装放低温环境，与采集记录一并寄送实验室检测。 保存完整的样本进行样品 DNA提取。 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 123 —2025 5附 录 A （资料性） 蝗虫微孢子虫生物学特性 A.1 分类地位 蝗虫微孢子虫（ Paranosema locustae ）是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物。 A.2 形态特征 在光学显微镜下观察到成熟孢子的大小在 2 µm到7 µm之间，形态主要以卵圆形或者梨形为主。在 电子显微镜可进一步观察到孢子的超微结构。孢子具有外壁和内壁，内壁厚度大约为 100 nm，具有选择 通透性，外壁厚度约 10 nm到200 nm之间。极管的长度通常介于 50-150 µm 之间，直径则在 0.1-0.2 µm 范 围内。孢子后端可见大量空泡，在未成熟的孢子外，有电子致密物质包裹，侧面起伏，带有两侧壳层的 胞质体紧密包裹在前端和后端的壳层，胞质体位于双核中央或双核稍微靠后处（图 1）。 图1光学显微镜下的蝗虫微孢子虫 A.3 生活史 微孢子虫生活史基本可概括为三个阶段：感染期（ Infective phase ）、裂殖增殖期（ Proliferative phase ） 和孢子形成期（ Sporognic phase ）。 感染期核心载体为成熟的孢子，是蝗虫微孢子虫实现宿主侵染且唯一能够在宿主细胞外存活的的阶 段。 裂殖增殖期是微孢子虫在寄主体内扩大种群数量的核心阶段。当孢子遇到适当的环境条件时，孢子 激活并通过中空的极管将孢原质转运宿主细胞，进入增值阶段。孢原质在其中发育成裂殖体，通过二分 裂或多分裂进行增殖。 孢子形成期裂殖体随着胞质分裂发育形成母孢子，并最终分裂形成孢子母细胞，孢子母细胞发育形 成成熟孢子。一旦宿主细胞不能再容纳更多成熟孢子，细胞就会破裂，释放成熟孢子到环境中，从而完 成微孢子虫的生命周期。 A.4 传播方式 A.4.1 水平传播 蝗虫微孢子虫在同一世代蝗虫群体内，通过健康蝗虫取食被孢子污染的食物或残食感病蝗虫尸体等 方式进行的传播。在适宜的环境条件下，孢子在蝗虫体内发育成熟后，又可随蝗虫粪便排出体外，再次 污染环境，继续传播给其他健康蝗虫。 A.4.2垂直传播 蝗虫微孢子虫由亲代蝗虫通过产卵将病原体传递给子代的传播方式。 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 123 —2025 6附 录 B （资料性） 原理和荧光定量PCR 产物信息 B.1 检测基因 蝗虫微孢子虫 16S rRNA 基因部分片段[1]，Genebank 登录号： AY305324 （1337 bp）。 B.2 原理 根据蝗虫微孢子虫的 16S rRNA 基因的保守序列设计特异性引物进行 PCR扩增反应。利用荧光信号随 着目的PCR产物的增加而增强的原理，统计 PCR扩增过程的荧光信号值，最后根据 Ct值来判断样品中是 否含有蝗虫微孢子虫。 B.3 扩增产物大小和序列 扩增产物为 59 bp。 CCGGAGGATCAAAGATGATTAGA TACCGTCGTAGTTCCGGCAGTAAACGATGCCGACGG 注：实线部分为引物序列，虚线部分为探针序列。 全国团体标准信息平台 T/ZBXH 123 —2025 7附 录 C （资料性） 仪器设备、试剂材料和样品DNA 提取 C.1 仪器设备 5430小型台式高速离心机； FA1104N 电子天平； Nano Drop2000 超微量分光光度计； MIKRO 20 0R离心机；荧光定量 PCR仪；DK-8D数显恒温水浴锅； TM-1F涡旋振荡器；研磨仪；灭菌的镊子和 手术剪刀； -20℃和-80℃冰箱；微量移液器和微量移液器枪头。 C.2 试剂材料 所需试剂材料包括： 裂解液A液：称取 2.4228 g 三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、1.755 g 氯化钠（ NaCl）、0.9305 g 乙二 氨四乙酸（ EDTA）和0.5 g十二烷基硫酸钠 (SDS)至烧杯中，加入超纯水溶解，定容到 100 mL，