ICS 11.220 B 41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4044—2020 禽腺病毒 4 型荧光定量 PCR 检测方法 Real-time PCR assay for the detection of fowl adenovirus serotype 4 2020 - 07 - 09 发布 山东省市场监督管理局 2020 - 08 - 09 实施 发 布 DB37/T 4044—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学家禽研究所。 本标准主要起草人：孟凯、吴家强、袁小远、宋敏训、张玉霞、杨金兴、艾武、亓丽红。 I DB37/T 4044—2020 禽腺病毒 4 型荧光定量 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了禽腺病毒4型（FAdV-4）荧光定量PCR检测方法。 本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及肝脏组织中FAdV-4的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试验原理 实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与DNA双链非特异性结 合的SYBR Green I荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急 剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变 化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 4 试剂或材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T 6682规定的一级水。 10×磷酸盐缓冲液 PBS：pH 值 7.2。 研钵。 病毒 DNA 提取试剂盒。 SYBR Green I qPCR 混合物。 5 阳性对照：浓度为 1.0×10 拷贝/μL 的阳性质粒。 阴性对照：水。 DEPC 水。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 微量可调移液器：最大量程为 10 μL、20 μL、100 μL、1 000 μL。 台式低温高速离心机：最高转速 16 000 r/min。 分析天平：精度为 0.01 g。 荧光定量 PCR 仪：温度范围 4.0 ℃～99.9 ℃。 冰箱：规格为 4 ℃和-20 ℃。 二级生物安全柜。 1 DB37/T 4044—2020 6 引物 P1：5’- GTCTATACCAACACGAGCACC-3’ P2：5’-TTTTGTACCCGTCGCAGAG-3’ 7 样品 7.1 采集工具 棉拭子，剪刀，镊子，1.5 mL离心管。 7.2 样品采集 7.2.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子 7.2.1.1 咽喉拭子采样：将棉拭子深入喉头来回刮 3 次，取咽喉分泌液，放于含抗生素（青霉素 2 000 U/mL+链霉素 2 mg/mL）的 10×磷酸盐缓冲液 PBS（pH 值 7.2）的 1.5 mL 离心管中。 7.2.1.2 泄殖腔拭子采样：将棉拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便（需有可见粪便），放于含抗生素（青 霉素 10 000 U/mL+链霉素 10 mg/mL）的 PBS 中。 7.2.2 组织样品 待检禽无菌采集整个肝脏，装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。 7.3 样品运输与保存 样品放于保温箱中加冰，密封，24 h内送至实验室，如不能立即检测，需将样品放于-20 ℃冰箱保 存。 7.4 样品处理 7.4.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子 将装有咽喉拭子/泄殖腔拭子的1.5 mL离心管在振荡器上充分混合后，取出棉拭子，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。 7.4.2 组织样品 将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（1：5～10）加入灭菌PBS进行充分研磨，4 ℃条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。 8 试验步骤 8.1 病毒 DNA 提取 用病毒DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待检样品的DNA。病毒DNA提取成功后置于-20 ℃保存 备用。 8.2 荧光定量 PCR 反应体系 详见表1。 2 DB37/T 4044—2020 表1 荧光定量 PCR 反应体系 试剂 使用量 * SYBR Green I qPCR 混合物 10 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L) 1 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 1 μL DNA 模板 2 μL DEPC 水 6 μL Total 20 μL 每次均应设阴性对照。 2+ * 内含DNA聚合酶，dNTP Mixture，Mg 和荧光染料SYBR Green。 8.3 荧光定量 PCR 反应程序设定 详见表2。 表2 荧光定量 PCR 反应程序设定 阶段 1：预变形 阶段 2：PCR 反应 阶段 3：溶解曲线分析 95 ℃，5 sec 95 ℃，5 sec 60 ℃，45 sec（收集荧光） 65 ℃，5 sec 40 Cycle 95 ℃，5 sec 95 ℃，1 min 1 Cycle 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。 9.2 试验成立条件 9.2.1 阴性对照无 Ct（或 Cp）值并且无扩增曲线。（参见附录 A.1） 9.2.2 阳性对照 Ct（或 Cp）值≤35，并出现特定扩增曲线。（参见附录 A.2） 9.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此试验视为无效。 9.3 结果描述及判定 9.3.1 阴性 无Ct（或Cp）值并且无扩增曲线，表明样品中无FAdV-4。 9.3.2 阳性 3 DB37/T 4044—2020 Ct（或Cp）值≤35，且出现特定扩增曲线，Tm值为86 ℃，表明样品中存在FAdV-4。（参见附录A.3） 9.3.3 有效原则 Ct（或Cp）值＞35的样品须复检，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。 4 DB37/T 4044—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 荧光定量标准曲线参考图 阴性曲线图见图A.1。 图A.1 阴性曲线图 阳性曲线图见图A.1。 图A.2 阳性曲线图 5 DB37/T 4044—2020 溶解曲线图见图A.3。 图A.3 溶解曲线图 _________________________________ 6