ICS 11.220 B 41 DB 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15/T 27—2020 代替 DB15/T 27-1992 禽霍乱防制技术规程 Prevention Technical Specifications for Avian cholera 2020-07-30 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-08-30 实施 发 布 DB 15/T 27—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准代替了DB15/T 27-1992《禽霍乱防制技术规程》，与DB15/T 27-1992相比，除编辑性修改外 主要技术变化如下： ——修改了诊断技术、防制措施和考核验收标准（见3、4、5，1992版的2、3、4） 。 本标准由内蒙古自治区农牧厅归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：申捷、马立峰、张伶俐、萨茹拉、郭宇、贾皓、云涛、戴晓光、苏胜杰、王永 杰、特木尔巴根、武娅楠、赵心力。 本标准的历次版本发布情况为： ——DB15/T 27—1992。 I DB 15/T 27—2020 禽霍乱防制技术规程 1 范围 本标准规定了禽霍乱的诊断技术、预防和控制措施。 本标准适用于饲养、经营、运输、屠宰、加工禽只的单位和个人。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存和运输技术规范 3 诊断技术 3.1 流行特点 本病是由多杀性巴氏杆菌引起的鸡、火鸡、鸭、鹅等多种禽类的传染病，鸡、火鸡、鸭、鹅等 家禽以及其他鸟类均易感，所有日龄禽类均可感染发病，但性成熟的成年鸡群更易感。本病一年四 季均可发生。本病呈世界性分布，急性暴发时，发病率和死亡率均很高。 3.2 临诊诊断 3.2.1 急性型症状 急性感染的禽群中禽只突然死亡，随后即出现感染禽只发热、厌食、沉郁、腹泻、羽毛粗乱、 呼吸困难，临死前鸡冠、肉垂呈黑紫色，鹅发病后肉髯肿胀，有热痛感，直至衰竭，昏迷而死。本 病病程短约半天，长约 1～3 d。 3.2.2 慢性型症状 急性型耐过或由弱毒菌株感染的禽只可呈慢性型病程，其特征主要表现为精神沉郁，食欲下降， 伴有不同程度腹泻，冠髯水肿，关节肿胀发炎可致跛行，口鼻分泌物增多。 3.3 病理变化 急性型的病变主要是全身出血，肝脏肿大，呈棕色或棕黄色，表面密布针尖大灰白色坏死点， 脾脏和肺脏均肿大，肺脏上可见出血点，心包增厚，心包液增多，肌胃出血，肠内容物含血液，有 出血性肠胃炎。慢性型主要是局部感染，在关节、趾垫、腱鞘、眼结膜、肉垂、气囊、中耳、骨髓、 脑膜等部位呈现纤维素性化脓性渗出、坏死或不同程度的纤维化。 3.4 实验室诊断 1 DB 15/T 27—2020 3.4.1 血清学诊断 3.4.1.1 琼脂扩散试验（该方法不适用于水禽） 3.4.1.1.1 配制琼脂板 取pH 6.4的0.01 mol/L PBS溶液 100 mL，放于三角瓶中，加入0.8 g～1.0 g琼脂糖，8 g氯化钠。 将三角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖熔化，再加入1 %硫柳汞1 mL，冷却至45℃～50℃时，将洁净干燥的直 径90 mm的无菌平皿置于平面上，每个平皿加入18 mL～20 mL琼脂糖溶液，加盖待凝固后，将平皿倒置 以防水分蒸发。放入普通冰箱中保存备用(时间不超过 2周)。若购买成品琼脂板试剂盒，可按照说明书 要求进行配制。 3.4.1.1.2 打孔和封底 可用直径 4mm 的打孔器在已凝固的琼脂板上打孔，然后小心将孔中的琼脂挑出，用酒精灯轻烤平皿 底部封闭孔的底部，以防侧漏。 3.4.1.1.3 加样 将稀释的抗原（按照试剂配制要求进行稀释）悬液滴入到中间孔，标准阳性血清加入外周的 1、4 孔中，标准阴性血清和待检血清按顺序分别加入外周 2、3、5、6 孔中。每孔均以加满不溢出为度。 3.4.1.1.4 感作 加样完毕后，静置 5 min-10 min 后倒置放入湿盒内，37℃中静置，分别在 24 h 和 48 h 观察结果。 3.4.1.1.5 结果判定 3.4.1.1.5.1 将琼脂板置于日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色 沉淀线，标准阴性血清与抗原孔之间不出沉淀线，则试验成立。 3.4.1.1.5.2 若被检血清孔与中心孔之间出现清晰沉淀线，并与阳性血清孔与中心孔之间沉淀线的末 端相吻合，则被检血清判为阳性；若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，但阳性血清孔与中心孔 之间的沉淀线一端在被检血清孔处向抗原孔方向弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性，应重复试验， 如仍为弱阳性，则判为阳性；若被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，标准阳性血清孔与抗原孔之 间的沉淀线指向被检血清孔，则被检血清判为阴性；若被检血清孔与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊 和标准阳性血清孔与中心孔之间的沉淀线交叉并直伸，待检血清孔为非特异性反应，应重复试验，若 仍出现非特异性反应则判为阴性。判阳性者视为禽体内存在禽霍乱抗体。 3.4.2 病原学诊断 3.4.2.1 涂片、镜检 用镊子夹持病变组织肝或脾，然后以灭菌剪刀剪取小块，夹出后将其新鲜切面在载玻片上压印或涂 抹成薄层；若取血液，用灭菌剪刀剪开心脏进行蘸取或剪取凝血块、用新鲜切面在载玻片上压印或涂抹 成薄层；若是已经培养纯化的细菌，从菌落挑取少量涂片。将制备好的涂片火焰固定后进行革兰氏和瑞 氏染色，镜检时多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，菌体大小为(0.2 µm～0.4 µm) ×(0.6 µm～2.5 µm)，单个或成对存在，瑞氏染色呈两极着染。 3.4.2.2 分离培养和鉴定 2 DB 15/T 27—2020 按照NY/T 541的要求采集并保存样品；最急性和急性病例，可采集濒死或死亡禽只的肝脏、脾脏、 心脏和血液等；慢性病例，一般采集局部病灶组织；活禽，通过鼻孔挤出黏液或将棉拭子插入鼻腔中采 样。对不新鲜或已被污染的样品，可采集骨髓样。将病料接种于5 %鸡血清的葡萄糖淀粉琼脂、鲜血琼 脂培养基或5 %鸡血清脑心浸出液琼脂培养基，在35℃～37℃下培养，经18 h～24 h后，菌落直径为1 mm～ 3 mm ，呈散在的圆形凸起，露滴样或水滴样。 3.4.2.3 动物试验 细菌纯培养物计数稀释后，以 1000 CFU 细菌经皮下或腹腔内接种小鼠、兔或易感鸡，接种动物在 24 h～48 h内死亡，并可从肝脏、心血中分离到多杀性巴氏杆菌。 3.4.2.4 多杀性巴氏杆菌 PCR 检测方法 3.4.2.4.1 器材 生物安全柜、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、恒温水浴锅、振荡器、离心机、高压灭菌锅、研钵。 3.4.2.4.2 试剂 Taq酶、DNA模板、dNTPs水、无菌双蒸水、DL2000DNA Marker、TAE、琼脂糖、。 3.4.2.4.3 DNA 模板的制备 3.4.2.4.3.1 组织样品制备 组织样品的处理：取约 0.5 g 的待检组织样品于灭菌干燥的研钵中充分研磨，加 2 mL 灭菌生理盐 水混匀。反复冻融 3 次，3000 r/min 离心 5 min，取上清液转入无菌的 1.5 mL 塑料离心管中并编号， 样本在 2℃～8℃条件下保存，应不超过 24 h。若需长期保存，应放在-70℃以下冰箱，但应避免反复冻 融。 纯化培养的细菌样品处理：对分离鉴定和纯化培养的细菌液体培养样品，直接保存于无菌的 1.5 mL 塑料离心管中密封，编号、保存和送检。 3.4.2.4.3.2 热裂解法 采用热裂解法提取DNA，用枪头挑取菌液或菌株培养物加入到含100 µL无菌双蒸水的离心管中，反 复吹打，沸水浴 10 min 后立即放入-20℃ 冰箱冷冻5 min，然后放入高速离心机12000 r/min 离心1 min， 上清液即为PCR扩增用 DNA 模板。 3.4.2.4.3.3 试剂盒法 采用试剂盒提取 DNA，取处理好的增菌培养物或组织样品，使用商品化的 DNA 提取试剂盒提取 DNA 做为模板，DNA 模板可置于-20℃保存备用。 3.4.2.4.4 PCR 反应体系 PCR反应体系见表1。 3 DB 15/T 27—2020 表1 PCR反应体系（总体积为20 µL） 10×Taq buffer(含 Mg2+) 2.0 µL dNTPs（2.5mmoL/L） 1.5 µL 引物 KMT I T7(10 µmol/µL) 1.0 µL 引物 KMT I SP6(10 µmol/µL) 1.0 µL 模板 DNA（样品） 1.0 µL 无菌双蒸水 13.0µL Taq DNA 聚合酶 0.5µL PCR 反应管中依次加入上述成分，充分混匀后，瞬时离心，确保所有反应成分混匀并集于管底。 3.4.2.4.5 PCR 对照 设立阳性对照和阴性对照，用菌数达到 108 CFU/mL 以上的液体培养基繁殖的多杀性巴氏杆菌 C48-1 株制备的 DNA 作为阳性对照，用无菌双蒸水作为阴性对照。 3.4.2.4.6 PCR 扩增程序 将反应管置于PCR仪内进行反应。反应条件如下：95℃预变性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，30个循环；72℃延伸10 min。若使用成品试剂盒，则可按照试剂盒说明书配制体系和设定反应条 件。 3.4.2.4.7 凝胶电泳 用TAE（配制方法见附录A）制备1.5 %琼脂糖凝胶，并在凝胶未冷却时加入溴化乙锭替代物，使其 最终浓度为0.5 µg/mL。待凝胶冷却后，在1×TAE缓冲液中进行电泳，将扩增产物和 Marker 分别加入 1.5 %琼脂糖凝胶孔中，每孔加10 µ L，80 V～100 V 电压电泳30 min，在紫外灯或凝胶成像仪下观察 结果。 3.4.2.4.8 结果判定 3.4.2.4.8.1 试验成立的条件 当阴性对照不出现条带，阳性对照扩增出DNA片段为460 bp的清晰条带，试验成立。（参照附录B 进行判定)。 3.4.2.4.8.2 结果判定 试验成立情况下，待检样品扩增出的 DNA 片段为 460 bp，可判定待检样品为阳性，否则待检样品 判为阴性。 4 防制措施 4.1 总则 贯彻“预防为主”方针，坚持自繁自养的原则，加强饲养管理，执行卫生消毒制度，提高禽群的机 体抵抗力。加强鸡群的饲养管理，平时应执行鸡场兽医卫生防疫措施，以栋舍为单位采取全进全出的饲 养制度，一般从未发生本病的鸡场不进行疫苗接种。 4 DB 15/T 27—2020 4.