ICS 11.220 B 41 DB 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15/T 99—2020 代替 DB15/T 99-1993 鸡白痢防制技术规程 Prevention technical specifications for pullorum disease 2020-07-30 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-08-30 实施 发 布 DB 15/T 99—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替了DB15/T 99—1993《鸡白痢病防制技术规程》，与DB15/T 99—1993相比，除编辑性修 改外主要技术变化如下： ——名称修改为《鸡白痢防制技术规程》； ——删除了扑灭标准及消灭标准（见1993版的4.1）； ——增加了净化标准的相关内容（见4.2.2）； ——修改了诊断技术（见2，1993版的2）。 本标准由内蒙古自治区农牧厅归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：萨茹拉、马立峰、郭宇、申捷、张伶俐、贾皓、云涛、苏胜杰、戴晓光、王永 杰、特木尔巴根、武娅楠、赵心力。 本标准的历次版本发布情况为： ——DB15/T 99—1993。 I DB 15/T 99—2020 鸡白痢防制技术规程 1 范围 本标准规定了鸡白痢的诊断技术、防制措施和净化措施。 本标准适用于饲养、经营、运输、屠宰、加工鸡（火鸡）的单位和个人。 2 诊断技术 2.1 流行特点 鸡白痢是由鸡白痢沙门菌引起的一种不同品种、不同日龄的鸡均易感的传染病。本病的传染源主要 是病鸡和带菌鸡，有水平传播和垂直传播多种途径，三周龄内雏鸡发病率和病死率高。 2.2 临诊诊断 2.2.1 雏鸡 潜伏期一般为 4 d～7 d。病雏表现为怕冷、精神沉郁、昏睡、羽毛逆立，排出白色粘稠或淡黄色、 淡绿色稀便，羽毛与肛门周围不洁。少数出现呼吸困难、关节肿胀、失明等症状，最后衰竭死亡。 2.2.2 育成鸡及成年鸡 多呈慢性或隐性感染，症状不明显，表现为因卵黄囊炎引起的腹膜炎，腹膜增生而呈“垂腹”现象， 母鸡产蛋量与受精率下降。 2.3 病理变化 2.3.1 雏鸡 多呈急性死亡，病理变化不明显。病程稍长呈现心肌、肺、肝、盲肠、大肠及肌胃肌肉中有坏死灶 或结节，胆囊肿大，输尿管扩张等病理变化。盲肠中有干酪样物，常有腹膜炎。稍大的病雏有出血性肺 炎，肺部有灰黄色结节。 2.3.2 育成鸡 肝肿大，呈现暗红色或深紫色，表面可见散在或弥散性的小红色或黄白色大小不一的坏死灶，质地 极脆，常见有出血变化。 2.3.3 成年鸡 成年母鸡常见为卵子变形、变色、呈现囊状，有腹膜炎及腹腔脏器粘连，常有心包炎。成年公鸡睾 丸极度萎缩，输精管腔增大，充满稠密的均质渗出物。 2.4 实验室诊断 2.4.1 细菌分离鉴定 1 DB 15/T 99—2020 2.4.1.1 采集病料 无菌采集被检鸡的肝、脾、肺、卵巢等脏器，取脏器组织 5 g～10 g，研磨后进行病原分离培养。 2.4.2 分离培养 2.4.2.1 试剂 增菌培养基：亚硒酸盐煌绿增菌培养基、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基。鉴别培养基：SS琼脂、麦康 凯琼脂。 2.4.2.2 操作 将研磨的病料分别接种在亚硒酸盐煌绿增菌培养基、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基、SS 琼脂或麦康 凯琼脂培养基平皿上，37 ℃培养 24 h～48 h，在 SS 琼脂或麦康凯琼脂培养基平皿上若出现白色或半透 明、圆形的光滑菌落，判定为可疑菌落。若在鉴别培养基上无可疑菌落出现时，应从增菌培养基中取 菌液在鉴别培养基上划线分离，37 ℃培养 24 h～48 h，若有可疑菌落出现，则进一步做鉴定。 2.4.2.3 病原鉴定 2.4.2.3.1 生化试验和运动性检查 2.4.2.3.1.1 试剂 三糖铁琼脂和半固体琼脂。 2.4.2.3.1.2 操作 将可疑菌落穿刺接种在三糖铁琼脂斜面，并在斜面上划线，同时接种在半固体培养基，37 ℃培养 24 h 后观察。 2.4.2.3.1.3 结果判定 若无运动性，并在三糖铁琼脂上出现阳性反应时，则进一步做血清学鉴定；若有运动性，说明不是 鸡白痢沙门菌感染。 三糖铁琼脂典型阳性反应为斜面产碱、变红，底层产酸、变黄；部分菌株斜面和底层均产酸、变黄， 半固体琼脂阳性反应为穿刺线呈现毛刷状。 2.4.3 全血或血清平板凝集试验 2.4.3.1 试剂 鸡白痢多价染色平板抗原、强阳性血清（500 IU/mL）、弱阳性血清（10 IU/mL）、阴性血清。 2.4.3.2 器材 玻璃板、移液器、枪头等。 2.4.3.3 操作步骤 在 20 ℃～25 ℃环境条件下，用移液器吸取抗原 30 μL，垂直滴于玻璃板上，然后取被检鸡的全血 或分离后所得血清 30 μL，与抗原混合均匀，并使其散开至直径约为 2 cm，计时判定结果。同时，设置 强阳性对照、弱阳性对照和阴性血清对照。 2 DB 15/T 99—2020 2.4.3.4 结果判定 2.4.3.4.1 凝集试验判定标准 100 %凝集（++++） ：紫色凝集块大而明显，反应液清亮； 75 %凝集（+++） ：紫色凝集块较明显，反应液有轻度浑浊； 50 %凝集（++） ：出现明显的紫色凝集颗粒，反应液较为浑浊； 25 %凝集（+） ：仅出现少量的细小颗粒，反应液浑浊； 2.4.3.4.2 0 %凝集（-） 无凝集颗粒出现，反应液浑浊。 2.4.4 PCR 检测 2.4.4.1 试剂 10×PCR Buffer、dNTP、Taq 酶、DL2000DNA Marker、乙醇、DEPC 水、TAE、琼脂糖、阳性对 照（已鉴定的鸡白痢沙门菌）和阴性对照。 2.4.4.2 器材 1.5mL灭菌离心管、恒温水浴锅、离心机、混匀器、电泳仪、PCR仪、凝胶成像仪等。 2.4.4.3 DNA 模板的制备 取灭菌的 1.5 mL 离心管，做好标识。每管加入 600 µL 裂解液，分别加入被检样本（增菌培养物、 研磨好的组织上清） 、阴性对照、阳性对照各 200 µL，再加入 200 µL 氯仿，混匀器上振荡混匀 5 s，于 4 ℃ 12000 r/min 离心 15 min；取灭菌的 1.5 mL 离心管，加入-20 ℃预冷 400 µL 异丙醇，吸取裂解好 的被检样本、阴性对照、阳性对照上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀；于 4 ℃ 12000 r/min 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入 600 µL 75 %预冷乙醇，颠倒洗涤；于 4 ℃ 12000 r/min 离心 15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；10000 r/min 离心 10 s，用微量加样器 将其吸干，室温干燥 5～10 min；加入 15 µL DEPC 水，溶解管底的 DNA，5000 r/min、离心 5 s，-20 ℃ 保存备用。 2.4.4.4 PCR 反应体系 PCR反应体系见表1。 表1 PCR反应体系（总体积为48 µL） 无菌超纯水 34.75 µL 10×PCR Buffer（含 Mg2+） 5 µL dNTP（2.5 mmol/L） 4 µL speC 上游引物（10 μmol/L） 1 µL speC 下游引物（10 μmol/L） 1 µL Taq 酶（5 U/μL） 0.25 µL DNA 模板 2 µL 3 DB 15/T 99—2020 2.4.4.5 PCR 扩增程序 将上述加有DNA模板的PCR管，置于PCR仪内进行反应。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸7 min。 2.4.4.6 电泳 用TAE（配制方法见附录A）制备1.5 %～2.0 %的琼脂糖凝胶，加样6 µL～8 µL，在电压80 V～ 100 V、电流40 mA下进行电泳30 min～40 min。 2.4.4.7 结果判定 2.4.4.7.1.1 试验成立条件 当阴性对照和空白对照不出现条带、阳性对照出现清晰条带，试验成立。 （参照附录 B 进行判定) 2.4.4.7.1.2 判定 若被检样品扩增出约252 bp的片段，判定为鸡白痢阳性。 3 防制措施 3.1 预防 3.1.1 消毒 3.1.1.1 制定生物安全制度，对进入鸡场的人员、物品等进行严格消毒。 3.1.1.2 鸡舍、鸡笼、墙面、地面、运输工具等可用 1 %的高效消毒剂、0.1 %的新洁尔灭、2 %的火 碱等药液定期喷洒消毒。 3.1.1.3 孵化设施在使用前用福尔马林密闭熏蒸消毒。 3.1.2 药物预防 用敏感类药物对初生雏鸡（1～15日龄）进行药物预防。 3.1.3 鼠害防控 鼠类是沙门菌的主要携带者，对鸡场进行灭鼠，防止由鼠类传播沙门菌。 3.1.4 饲料防控 对购入的饲料进行隔离、检疫、消毒，合格的饲料方可进入鸡场。 3.2 检疫净化 3.2.1 蛋用种鸡场须在开产前，通过全血或血清平板凝集试验进行 2 次检疫，相隔时间不得少于 21 天，检出并淘汰阳性鸡。 3.2.2 肉用种鸡场须在 45 日龄至开产之间，通过全血或血清平板凝集试验每月检疫 1 次，相隔时间不 得少于 21 天，检出并淘汰阳性鸡。 3.2.3 商品代饲养场户以预防为主，引入的鸡只应选自检疫鸡白痢沙门菌且为阴性的鸡场。 4 DB 15/T 99—2020 4 疫病控制 4.1 疫病控制方法 4.1.1 坚持自繁自养，需引进鸡只时提前检测鸡白痢沙门菌。 4.1.2 制定完善的生物安全制度，严格管控进入鸡场的人员、设备、车辆、物品等。 4.1.3 对进入鸡场的人员、设备、车辆、物品等进行彻底清理及消毒。 4.1.4 对出现全血或血清平板凝集试验阳性的鸡只及时淘汰，并对病鸡所在鸡笼、饲料槽、饮水槽等 进行彻底清理及消毒，同群鸡只隔离观察两周后，无异常情况的可在无污染区域进行饲养。 4.2 疫病控制要求 4.2.1 控制标准 连续两年每个月抽检存栏数的1 %～2 %，用全血或血清平板凝集试验检测，抽检阳性率在0.5 %以 下即达到控制要求。 4.2.2 净化标准 达到控制标准后，每个月抽检全群，连续两年全血或血清平板凝集试验检测结果均为阴性即达到净 化标准。 5 DB 15/T 99—2020 附录 A （规范性附录） PCR 反应溶液的配制 TAE 电泳缓冲液（pH 约 8.5）的配制要求如下： 50×TAE 电泳缓冲储存液 三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱） 242 g 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA） 37.2 g 双蒸水 800 mL 待上