ICS 11. 020 05 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 263482010 蚊虫抗药性检测方法 不敏感乙酰胆碱酯酶法 Test methods of mosquito resistance to insecticides- Test methods of insensitive acetylcholinesterase for the mosquito 2011-01-14发布 2011-05-01实施 中华人民共和国卫生部 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T26348—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所、中国农业大学、北京市疾 病预防控制中心。 本标准主要起草人:赵彤言、汪中明、李春晓、董言德、高希武、曾晓芃、佟颖 1 GB/T26348—2010 蚊虫抗药性检测方法 不敏感乙酰胆碱酯酶法 1范围 本标准规定了蚊虫体内不敏感的乙酰胆碱酯酶(AChE)的检测方法。 本标准适用于淡色库蚊(Culerpipienspallens)、致倦库蚊(Cr.pipiensquinquefasciatus)、白纹伊 蚊(Aedesalbopictus)、中华按蚊(Anophelessinensis)等对有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂抗性的生物 化学检测。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 乙酰胆碱酯酶区分浓度 discriminating concentration of acetylcholinesterase 能够抑制敏感蚊虫乙酰胆碱酯酶生理活性90%的杀虫药剂的浓度。 3试虫 现场多点采集幼虫,室内饲养,采用羽化后3d~5d未吸血雌蚊进行检测,冰浴条件下储存不超过 4试剂 4.1磷酸氢二钠(NazHPO,),分析纯。 4. 2 磷酸二氢钾(KH,PO,),分析纯。 4. 3 曲拉通X-100(TritonX-100)。 4.4 乙酰硫代胆碱(ATCh),分析纯。 4.5 5,5-二硫双硝基苯甲酸(DTNB),分析纯。 4. 6 磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.5PBS):称取30.18gNazHPO4·12H,O和2.16gKHzPO4,蒸馏 水定容至1000ml。 4.7DTNB-乙醇显色剂:12.4mgDTNB.加120mL95%乙醇,80mL蒸馏水,50mL磷酸盐缓冲液 (pH7.5,0.1mol/L,含0.1%TritonX-100)。 4.9ATCh-DTNB混合溶液:称取75mgATCh和13mgDTNB,用100mL磷酸盐缓冲液溶解。 5分光光度法 5.1仪器设备 5.1.1分光光度计。 1 GB/T26348—2010 5.1.2恒温水浴箱。 5.1.31mL玻璃组织勾浆器。 5.1.4离心机(离心力10000g以上)。 5.1.5加液器。 5.2操作步骤 5.2.1酶源的制备取成蚊5只做为1组,放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加入0.5mL磷酸盐 缓冲液(pH7.5.0.1mol/L,含0.1%TritonX-100),充分匀浆。匀浆液在4℃,5000g离心5min取 上清液作为待测酶液,冰浴保存备用。 5.2.2取6支试管,分别加人6.1.1中制备酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加人0.1mL的杀虫 剂溶液,充分混匀,使其终浓度达到区分浓度(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附 录A表A.1),且丙酮终浓度小于1%。另3支试管中加入0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管; 再取1支试管加入0.2mL磷酸盐缓冲液,作为空白对照。 5.2.3上述7支试管30℃保温5min后,分别加人0.1mL0.01mol/L乙酰硫代胆碱(ATCh),在 30℃继续保温15min后,加人3.6mLDTNB-乙醇显色剂。 5.2.4将空白对照调至仪器显示为0点,在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂 处理管的光密度值(OD412),计算平均值。 5.2.5按上述方法每个种群检测100组蚊虫。 5.3结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(1): E= (1) OD. 式中: E 一AChE残存活性; OD,—药剂处理管平均光密度值ODa12; OD——无药剂对照管平均光密度值ODa12。 5.4判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的蚊虫组为对有机磷或氨基甲酸 酯类药剂抗性组,抗性组在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群。 6酶标仪法 6.1仪器设备 6.1.1酶标仪。 6.1.2恒温水浴箱。 6.1.31mL玻璃组织匀浆器。 6.1.4离心机(离心力10000g以上)。 6.1.5加液器。 2 GB/T26348—2010 6.2操作步骤 6.2.1酶源的制备取成蚊1只,放入4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加人0.5mL4℃预冷的磷酸盐 缓冲液充分匀浆。匀浆液在4℃,5000g离心5min,取上清液作为待测酶液,冰浴保存备用。 6.2.2分取0.1mL6.2.1中制备酶液到酶标板的3个孔中,再在各孔中加人0.1mL杀虫剂溶液杀 虫剂用磷酸缓冲液稀释,使其终浓度达到区分浓度(常用杀虫剂对淡色库蚊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参 见表A.1),且丙酮的终浓度不超过1%。以0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照,加人另外3个孔 中。在30℃保温5min后,分别加人0.2mLATCh-DTNB混合溶液,在412nm测定5min时间动力 学曲线,曲线的斜率作为反应初速度()。计算平均值。 6.2.3按上述方法每个种群检测100只蚊虫。 6.3 结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(2): ..(2 ) Ue 式中: E 一AChE残存活性; 药剂处理组平均反应初速度; Ue 无药剂对照组平均反应初速度。 6.4判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的蚊虫为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂抗性个体,抗性个体在检测种群中的比例达到10%时为抗性种群。

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