ICS 11. 020 05 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T263492010 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法 Test methods of fly resistance to insecticides- Test methods of insensitive acetylcholinesterase for musca domestica 2011-01-14发布 2011-05-01实施 中华人民共和国卫生部 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T26349—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的起草规则起草。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位:中国农业大学、北京市疾病预防控制中心、中国人民解放军军事医学科学院微生 物流行病研究所。 本标准主要起草人:高希武、曾晓芃、梁沛、马彦、刘婷、颖、赵彤言 1 GB/T 26349—2010 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法 1范围 本标准规定了家蝇(Muscadomestica)不敏感乙酰胆碱酯酶(AChE)的检测方法。 本标准适用于家蝇对有机磷、氨基甲酸酯类药剂抗药性的生物化学检测。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 乙酰胆碱酯酶区分浓度 discriminating concentration of acetylcholinesterase 能够抑制敏感品系家蝇乙酰胆碱酯酶正常活性90%的杀虫药剂的浓度,单位为mol/L或 mmol/L. 2. 2 F1 代 F1generation 从现场捕提捉的家蝇,繁殖后得到的第一代。 3试虫 现场采集家蝇,室内饲养,羽化后3d~5d的F1代雌性家蝇。冰浴条件下储存不超过1d, 4试剂 4.1 磷酸氢二钠(NazHPO,),化学纯。 4.2磷酸二氢钾(KH,PO),化学纯。 4.3曲拉通X-100(TritonX-100)。 4.42 乙酰硫代胆碱(ATCh),分析纯 4.55,5-二硫双硝基苯甲酸(DTNB),分析纯。 4.6磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.5PBS):称取30.18gNazHPO,·12H,O和2.16gKH,PO,蒸馏 水定容至1000mL。 4.7DTNB-乙醇显色剂:称取12.4mgDTNB,溶于125mL95%乙醇中,加人50mL磷酸缓冲液,最 后用蒸馏水定容至250mL,4℃避光保存。 4.8 ATCh溶液:称取28.9mgATCh溶于10mL蒸馏水中,一20℃避光保存。 5分光光度法 5.1仪器设备 5.1.1分光光度计。 1 GB/T 26349—2010 5.1.2恒温水浴箱。 5.1.3玻璃组织匀浆器。 5.1.4台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。 5.1.5加液器。 5.2杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,试验前用磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonX 在反应体系中的最终浓度应小于1%。 5.3操作步骤 5.3.1取家蝇1只,用眼科剪刀或手术刀片将头部剪(切)下,放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器(1mL) 中,加人0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonX-100),充分匀浆。 5.3.2匀浆液在4℃,10000g离心15min,取上清液即为酶液,冰浴保存备用。 5.3.3取4支试管,分别加人上述酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加入一定量的杀虫药剂溶液 0.1mL,使其终浓度达到区分剂量,第4支试管中加人0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;另取 1支试管加入0.2mL磷酸盐缓冲液,作为空白对照。 5.3.4上述5支试管30℃保温5min后,分别加人0.1mLATCh,在30℃继续保温15min后,加人 1.6mLDTNB-乙醇显色剂。 5.3.5以空白对照调仪器0点,在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的 光密度值(OD412)。 5.3.6按上述方法每个种群检测100只家蝇。 5.4结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(1): OD×100% E= .(1) OD. 式中: E —AChE残存活性; OD——药剂处理管平均光密度值OD12 OD。——无药剂对照管平均光密度值ODa12。 5.5判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群。 6酶标仪法 6.1仪器设备 6.1.1酶标仪。 6.1.2恒温水浴箱。 6.1.3玻璃组织匀浆器。 2 GB/T26349—2010 6.1.4台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。 6.1.5加液器。 6.2杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,试验前用磷酸盐缓冲液(含0.1%Triton X-100)稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度见附录A表A.2)的 2.5倍,溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1%。 6.3操作步骤 6.3.1取家蝇1只,用眼科剪刀或手术刀片将头部剪下,放人4℃预冷的玻璃组织勾浆器(1mL)中, 加入0.5mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonX-100),充分匀浆。 6.3.3在酶标板孔中加人0.1mL酶液,在每个孔中分别加人0.05mLDTNB和0.1mL含抑制剂的 ATCh溶液,抑制剂终浓度为区分浓度,每只家蝇设无抑制剂对照一个,用缓冲液代替抑制剂量,在酶标 仪中读数5min,曲线的斜率作为反应初速度(v)。计算平均值。 6.3.4按上述方法每个种群检测100只家蝇。 6.4结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(2): E=竺×100% .(2) Ve 式中: E 一一AChE残存活性; 药剂处理组平均反应初速度; 无药剂对照组平均反应初速度。 6.5判别标准 类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群。

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