ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28642—2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应（PCR)法 Rapid determination of Salmonella spp. in animal feeding stuffs- PCR method 2012-07-31发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28642—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心（沈阳） 本标准主要起草人：张秀芹、张建勋、杜柏林、李欣南、杨希国、马俊驰、陈晓月 GB/T28642—2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应（PCR）法 1范围 本标准规定了饲料中沙门氏菌的快速检测的PCR方法。 本标准适用于饲料中沙门氏菌的定性筛选。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T13091饲料中沙门氏菌的检测方法 GB/T14699.1饲料采样 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 SN/T18701 食品中致病菌检测方法实时PCR法 3原理 利用沸水浴使菌体细胞破裂，释放基因组DNA，离心使细胞壁等有形物沉淀，以上清液为模板进行 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。 4试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682的要求 4.1沙门氏菌检测用引物（对）序列为： Sal F:5'-TCG CAC CGT CAA AGG AAC CGT AAA GC-3' Sal R:5'-GCA TTA TCG ATC AGT ACC AGC CGT CT-3' 4.2PremixTaq缓冲液（2X）：内含TaqDNA聚合酶1.25U/25μL，4mmolMg²+，dNTP 各0.4mmol。 4.3琼脂糖：电泳级。 4. 4 Marker2000 4.5 缓冲蛋白陈水（BPW)：见A.1。 4.6 大豆蛋白陈肉汤（RVS）：见A.2。 4.7 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC)：见A.3。 4.8 10倍上样缓冲液（10×loadingbuffer）：0.05%的溴酚蓝，50%丙三醇溶液，1%的SDS。 4. 9 质控菌株：沙门氏菌阳性标准菌株。 4.10 50×TAE缓冲液：见A.4。 1 GB/T28642—2012 4.111XTAE缓冲液:见A.5。 4.12溴化乙锭（5mg/mL）：见A.6。 注：4.2和4.8缓冲液为商品化成品。以上用于PCR反应及电泳试验的试剂可用功能相当的其他产品替代。 5仪器设备 5.1 PCR仪。 5.2恒温水浴锅。 5.3离心机：离心转速12000g。 5.4 微量移液器。 5.5电泳仪。 5.6凝胶成像仪。 5.7天平：感量0.01g。 5.8电热恒温培养箱。 6 试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样，将实验室样品充分混匀后密封低温保存待用，注意整个过程中不要将样 品人为污染。 7检验步骤 7.1样品的增菌及模板的制备 同时取10mL预增菌液于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC.4.7）中37℃土1℃培养24h土3h，进 行选择性增菌，取选择性增菌液1mL于离心管中10000g离心10min，弃上清，1mL无菌去离子水悬 浮离心10min，弃上清，再用0.2mL无菌去离子水悬浮，95℃水浴20min，将离心管迅速转移至冰浴 中使其迅速冷却，用涡旋仪混匀裂解物，20℃～25℃下10000g离心3min，转移上清至新鲜管中备用 （模板制备可选用商业试剂盒）。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照，用添加沙门氏菌阳性标准菌 株的样品作阳性对照，用不含沙门氏菌的样品作阴性对照。 7.2PCR扩增 50uL的反应体系，在0.2mL的反应管中，PremixTag缓冲液（4.2）25uL，模板4uL，浓度为 20μmol/L的上下游引物各1μL，去离子水19μL。 反应程序为：94℃预变性2min，30个循环：94℃变性1min，58.4℃退火40s，72℃延伸30s； 72℃终延伸7min后4℃保存。 7.3电泳检测PCR扩增产物 取1.5g琼脂糖（4.3），于100mL1×TAE缓冲液（4.11)中加热，充分熔化，冷至65℃左右的时 候，加入10L溴化乙锭（4.12），充分混匀，根据需要在模板内放入合适的梳子，制成约5mm厚的胶 块。在电泳槽中加人1XTAE缓冲液，使液面没过凝胶2mm~3mm。将6μL~8μL的PCR扩增产 物与1μL10倍上样缓冲液（4.8）混合后点样，取6μLMarker2000（4.4）点样。5V/cm～8V/cm恒 压电泳，直至漠酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，用成像仪进行凝胶成像。 2 GB/T28642—2012 8 结果表述 在阴性对照于330bp处未出现条带，而阳性对照在330bp处出现扩增条带的条件下，如待测样品 在330bp处未出现相应大小的扩增条带，则可报告待测样品未检出沙门氏菌；如待测样品在相应处出 现扩增条带，则为疑似阳性样品，此时需用GB/T13091进行确证，最终结果以后者检测结果为准。对 于疑似阳性样品，可以对其扩增产物进行测序，结果参照附录B。 如果阴性对照出现条带和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应 重新进行检测，并排除污染因素。 检测过程中防止交叉污染的措施 9 按照SN/T1193、SN/T1870和GB19489的要求执行。 10 废弃物处理 检测过程中的废弃物及一切可能被污染的物品均应做无害化处理。 3