ICS 07.080 A40/49 GD 中华人民共和国国家标准 GB/T32132—2015 动物性材料（羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒）属 性DNA鉴定方法 实时荧光PCR法 DNA identification of wool, cashmere, duck's down, goose's down animal materialsReal-time fluorescence PCR method 2015-10-09发布 2016-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T32132—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、珠海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈国培、赖心田、林霖、周李华、梁玉英、莫秋华、洪晓明、唐复润、胡科新、 何永盛、杨友红、杨志敏、杨国武、杨泽。 I GB/T32132—2015 动物性材料（羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒）属 性DNA鉴定方法实时荧光PCR法 SAG 1范围 本标准规定了羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒动物性材料中DNA成分实时荧光PCR定性检验方法。 本标准适用于动物性材料中羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒等动物源性DNA成分的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 荧光PCR检测的DNA。同时依据多种动物的物种特异性基因片段设计成特异性荧光引物，通过实时 荧光PCR反应，检测其中是否含有各种动物源性DNA成分，从而达到对动物性材料进行属性DNA成 分定性检测的目的。 4仪器设备及器具 4.1 实时荧光PCR仪 4.2 超净工作台。 4.37 离心机（最高转数15000g）。 4.4 微量移液器：0.2μL~2μL,1μL~10μL,2μL~20μL,20μL~200μL,200μL1000μL。 4.5 恒温水浴锅：（65土1)℃。 4.6 超纯水系统（电阻率>18.2M2·cm）。 4.7 紫外分光光度计：230nm260nm、280nm。 5试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求。 5.12%SDS溶液：称取2gSDS（sodiumdodecylsulfate，sodiumsalt，十二烷基磺酸钠）粉末，加人 5mL1mol/LTris-HCl(pH8.o)[Tris-：tris（hydroxymethyl）aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷」 及4mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）（ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸），加水定容至 100mL，室温保存。 5.2异硫氰酸胍提取液：称取47.25g异硫氰酸胍、1.75g氯化钠、4gPVPK-40(Polyvinylpyrrolidone K-40,聚乙烯吡咯烷酮K-40），加人5mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）及4mL0.5mol/LEDTA 1 GB/T32132—2015 （pH8.0），加水定容至100mL，室温保存。 5.31mol/LTris-HCl(pH8.0）：800mL水中溶解121.1gTris碱，盐酸调pH值至8.0，加水至 1000mL，高压灭菌，室温保存。 5.40.5mol/LEDTA（pH8.0）：800mL水中溶解186.1g乙二胺四乙酸二钠盐，NaOH调pH值至 8.0，补水至1000mL，高压灭菌，室温保存。 5.53mol/L乙酸钠溶液：称取408.1g三水乙酸钠，加人800mL水溶解，用冰乙酸调节pH值至5.2， 加水定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。 5.6酚：氯仿：异戊醇：25：24：1（体积比）。 5.7担体：非同一物种的植物或非脊椎动物基因组DNA，推荐使用糖原。 5.8无水乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇等有机试剂。 5.9PremixExTaq（2×），也可用等效的其他Taq酶或Taq酶预混液。 5.10引物和探针：动物性材料中羊毛、羊绒、鸭绒、鹅绒等动物源性DNA成分实时荧光PCR检测所用 的荧光引物序列见表1。 表1实时荧光PCR检测所用荧光引物序列 检测基因 引物序列 探针序列 脊椎动物 5'-AGATAGAAACCGACCTGGATT-3' 5'-FAM-TCCGGTCTGAACTCAGATCACGTA-BHQ-3" 内参照基因 5′-TTTACGACCTCGATGTTGGAT-3' 羊毛内源基因 5-ACTTCCAATCAGTGAAATTGAC-3" 5'-FAMTGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGA-BHQ3" 羊绒内源基因 5′-TTCTCCGAGGTCACCCCAA-3' 5'-FAM-ACATAATTAATACCACGTAAATGCCAA-BHQ-3 鸭绒内源基因 5'-ACGTACATACCGCCCGTCA-3' 5-FAM-ACATAACTAATACCCTAAACATGCCAA-BHQ-3" 5'-ATTCTAAGTACACCTTCCGGT-3' 鹅绒内源基因 5'-FAM-ATAACTAATACCATAAATACGCTGAA-BHQ-3" 6操作步骤 6.1 模板DNA的提取 6.1.1十二烷基磺酸钠-异硫氰酸胍-β-巯基乙醇DNA提取法 于样品不同部位取样，取0.05g~0.1g剪碎样品，加人3mL2%SDS溶液，65℃水浴1.5h，不时 振荡；12000g离心5min，弃去上清液；加入3mL异硫氰酸胍提取液及60μLβ-疏基乙醇，65℃水浴 4.5h，不时振荡；12000g离心5min，吸取上清液；加人等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混 匀；12000g离心10min；吸取上清液，加人3L20mg/mL糖原，1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液 （pH5.2）及等体积异丙醇，一20℃沉淀过夜，12000g离心15min收集沉淀；小心倒去上清，用70%乙 醇洗涤二次，风干；加入50μL灭菌去离子水溶解沉淀。 6.1.2模板DNA提取的其他办法 可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 6.1.3样品DNA质量评估 取10μLDNA溶液加蒸馏水稀释至1mL,用紫外分光光度计分别测定260nm和280nm的吸光 2 GB/T 32132—2015 值，DNA的浓度按照式（1)计算，当OD260/OD28比值在1.5～2.0之间时，符合PCR检测要求。扩增前 将所有样品DNA调至约10ng/μuL～100ng/μL。 c=AXNX500/1000 ..(1) 式中： DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）； A 260nm处的吸光值； N 核酸稀释倍数。 6.2 试样的PCR反应 6.2.1 阳性对照和空白对照的设置 6.2.1.1 阳性对照 以含所检源性成分的动物性材料及其加工产品的DNA为模板。 6.2.1.2 阴性对照 以不含所检源性成分的动物性材料及其加工产品的DNA为模板。 空白对照 6.2.1.3 设置两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以 水代替DNA模板）。 6.2.2 实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全落人 反应液中，不要粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。 表2实时荧光PCR反应体系 试剂名称 体积 Premix Ex Taq(2X) 10 μL 10μmol/L引物（上游） 0.4 μL 10μmol/L引物（下游） 0.4 μL 0.2 μL 10μmol/L探针 DNA模板 10ng~100ng 补水至 20 μL 注：表中DNA模板的加样量，可视所提取DNA的浓度适当增减模板量。 6.2.3 实时荧光PCR反应参数 实时荧光PCR反应参数为：预变性95℃30S.95℃5S.60℃34S，40个循环。 注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。