ICS 65.150 B 51 GB 中华人民共和国国家标准 GB20554—2006 海带 Kelp 自2017年3月23日起,本标准转为推荐性 标准,编号改为GB/T20554-2006。 2006-09-29发布 2006-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 根据中华人民共和国国家标准公告(2017年第7 号)和强制性标准整合精简结论,本标准自2017 GB20554—2006 年3月23日起,转为推荐性标准,不再强制执行。 前言 本标准的第3章为强制性条款,其余为推荐性条款 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。 本标准主要起草人:干飞久、段德麟、刘涛、陈四清、张岩、高淳仁、干东祥、崔竞进 GB20554—2006 海带 1范围 本标准给出了海带(Laminariajaponica Aresch)的名称与分类、主要形态构造特征、生活周期与繁 殖、遗传学特征以及检测方法。 本标准适用于海带的种质监测和鉴定。 2名称与分类 2.1学名 海带(Laminaria japonica Aresch)。 2.2分类位置 褐藻门(Phaeophyta)、游孢子纲(Phaeosporeae),海带目(Laminariales)、海带科(Laminariaceae)、 海带属(Laminaria Lamx.)。 3主要形态构造特征 3.1孢子体外部形态特征 藻体明显分为固着器、柄和叶片三部分。海带孢子体外部形态见图1。 1——固着器; SAC 2——柄; 3叶片; 4——纵沟; 5——中带部; 6—叶缘部。 图1海带孢子体的外部形态 3.1.1 固着器 由多次双分枝的圆柱形假根组成,其末端有吸盘。 3.1.2柄 呈圆柱形或扁圆柱形,深褐色,成藻柄长3cm~6cm。 3.1.3叶片 带状,褐色具光泽,基部幼时楔形,厚成阶段为扁圆形。养殖的海带成藻一般长2m~4m,宽 20cm~40cm。野生的海带成藻一般长0.8m~1.8m,宽8cm~20cm。有两条浅的纵沟贯穿叶片的 中部形成较厚的中带部,叶片边缘薄而软,有波褶。 1 GB 20554—2006 3.2孢子体内部构造特征 柄和叶片均分三层组织,外层为表皮,其内为皮层,中央为髓部。 3.2.1表皮 由一层个体小、排列紧密和整齐的细胞组成,呈栅栏状。细胞含粒状色素体 3.2.2皮层 外皮层细胞呈柱状,大小不等,排列不整齐。内皮层细胞大小相近,排列较整齐。 3.2.3髓部 由喇叭丝和髓丝组成。 4生活周期与繁殖 4.1生活史 明显的孢子体(2n)与配子体(n)不等世代交替型) 4.2生命周期 海底自然繁生的海带,其寿命为两年。 4.3繁殖 4.3.1性成熟年龄 10个月~12个月。 4.3.2无性繁殖 孢子体产生单室孢子囊群,每个孢子囊内形成32个游孢子。游孢子单细胞,梨形,长6.9um~ 8.2μm,宽4.1μm~5.5μm,有两条侧生不等长鞭毛,前面一条长17.8μum~19.6um,后面一条长 6. 9 μm~8. 2 μm。 4.3.3有性繁殖 卵配方式。雄配子体产生精子囊,每个精子囊产生一个梨形精子。精子长4.4um~6.2um,宽 精子(n)与附着在卵囊口处的卵(n)结合生成合子(2n)。 5遗传学特征 5.1染色体数 孢子体细胞染色体数2n=44。 5.2DNA序列特征 5.2.1ITS-1序列:总长度238bp。 1 CCGAAAGCGG GTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCTATAAATT GTCTGTGAGG CCGCTTCGTG 121AGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCAC ATTTCAACCC ATTAAACTCT 181GAATCTGAACTCAAAGGGGC GCTGCGCTAGCCGCGGCTCC CCCAACCTTT AACGTTGT 5.2.2ITS-2序列:总长度258bp。 1GACACCACTCGCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTT 61GAGTGTTCCG GAGTTCCCATGCTCCGAGTG CACCTAATCT CGTGAACGAA GCCTCTCGCG 121 CCCTGCCGCACAGAGTTGTT GACGGCGCTCGCTTCGGCGG CGACTCTCGA CTCACCAAAC 181GTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCG ACCCTTCTGG GTCAGCGTCG 241 GAAACCGTAC CACTTTCG 2 GB20554—2006 6检测方法 6.1形态构造检验 采用肉眼和显微镜观察相结合的方法。 6.2染色体检验 6.2.1标本的制备 压片法。 6.2.2染色液 2%(质量分数)地衣红溶于70%(体积分数)的乙酸中。 6.2.3染色方法 固定材料在自来水中浸泡15min~30min后压片。揭开盖片,滴入醋酸地衣红后盖片0.5h,用滤 纸吸出多余的染色液,石蜡封片。 6.3海带ITS序列的检测 6.3.1海带配子体DNA的提取 取约1g(湿重)的海带配子体,加少量石英沙和PVP-40,在液氮中研成粉末。将粉末转至50mL 的离心管中,加人15mL裂解缓冲液(10mmol/LTris-HCl,1ommol/LEDTA,1.0mol/LNaCl, 1.0%CTAB,1%SDS,pH8.0),在65℃保温1h,期间摇匀几次。用同体积的三氯甲烷十异戊醇 (24十1)抽提一次,再将水相转移至一新的50mL离心管中,加人1/3体积的4mol/LTris-HCl, 1mmol/LEDTA,pH8.0中,加2μLRNaseA,37C保温1h,再用三氯甲烷+异戊醇(24+1)抽提一 次,异丙醇沉淀回收DNA。DNA最后溶于一定体积的TE中,检测DNA的浓度。 6.3.2ITS特异性扩增 总反应体积为20μL,含10mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgClz, Taqpolymerase1U,4种dNTP各2mmol/L,两个引物各4mmol/L~6mmol/L,模板DNA10ng, 其余用双蒸馏水补满。 PCR反应参数:96℃预变性5min;96℃、30s,72℃、60s,55℃、30s,37个循环;72℃,保温5min。 6.3.3ITS序列扩增引物 正向引物:5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3。 反向引物:5'-AATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTC-3°。 6.3.4测序 参照DNA测序仪进行测序,见附录A。 6.4判定规则 以第3章为主,结合第4章、第6章判断检验样品结果。经检验,符合上述质量要求的样品为合格 样品。

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