ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 38165—2019 人体外周血中循环游离DNA浓度检测 基于Alu序列实时荧光PCR法 Detection of circulating cell-free DNA concentration in human peripheral blood- Real-time PCR method based on Alu sequence 2019-10-18实施 2019-10-18发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T38165—2019 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草, 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位:成都中医药大学、四川省肿瘤医院、上海市计量测试技术研究院 本标准主要起草人:何洋、肖洪涛、宋填、李燕、闻艳丽、冷平、刘刚、李东梅。 GB/T381652019 人体外周血中循环游离DNA浓度检测 基于Alu序列实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了人体外周血中循环游离脱氧核糖核酸(DNA)基于Alu序列的实时荧光聚合酶链式 反应(PCR)定量检测方法。 本标准适用于循环游离DNA样品中Alu序列的定量检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 循环游离DNAcirculatingcell-freeDNA;cfDNA 血液中来源于细胞凋亡和坏死的细胞外游离状态的短片段DNA 3.2 实时荧光PCR real-timePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程,实现对起始 模板的定量及定性分析 3.3 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.4 Alu序列Alusequence 散在分布于灵长类动物基因组中的中度重复序列。 注:Alu序列具有70%~98%同源性,占人类基因组序列的5%~10%,每个元件长度约为300bp。 4原理 以提取的外周血循环游离DNA作为检测目标样品,以符合要求的人基因组DNA定量标准物质为 标准品,采用实时荧光PCR技术,设计特异性引物分别扩增Alu序列中长度为115bp和219bp的片 段,以标准品起始模板DNA浓度的对数为横坐标,Ct值为纵坐标,制作标准曲线。根据标准曲线方程 计算样品中的Alu序列拷贝数,结果用copies/μL表示 1 GB/T38165—2019 5引物 扩增Alu序列引物序列参见表1。 表1引物序列 引物名称 序列(5'-3') 碱基数 产物长度/bp Alul15F CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG 20 115 Alul15R CCCGAGTAGCTGGGATTACA 20 Alu219F CACGCCTGTAATCCCAGCACTTT 23 219 Alu219R ATCTCGGCTCACTGCAACCTCC 22 6 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。试验用水符合GB/T6682中一级水的要求 6.1 循环游离DNA提取试剂盒 推荐使用基于磁珠法的循环游离DNA提取试剂盒。 6.2 实时荧光PCR反应混合液 20μL反应体系含1U~2U的TaqDNA聚合酶、1×PCR缓冲液、2.0mmol/L的Mg²+,0.2U UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs(dATP为脱氧腺苷三磷酸,dCTP为脱 氧胞苷三磷酸,dGTP为脱氧鸟苷三磷酸)、O.2mmol/LdUTP(脱氧尿苷三磷酸)、SYBRGreenI荧光 染料。或者仪器配套的等效SYBRGreen法的实时荧光PCR反应混合液。 6.3DNA标准物质 可定量Alu序列拷贝数的DNA标准物质,用于建立样品定量检测所需的标准曲线。 6.4参比染料(ROX) 根据具体仪器需求决定使用与否。 7 仪器设备 7.1 实时荧光PCR仪。 7.2恒温金属浴。 7.3 高速离心机。 7.4 微量移液器:0.5μL~10μL、10μL~100μL20μL~200μL、100μL~1000μL。 8 检验步骤 8.1 循环游离DNA提取 循环游离DNA按下列步骤提取: 2 GB/T38165—2019 避免吸到中间层的白细胞; b) 再次以4℃16000×g离心10min去除残余细胞,将上清转人新的离心管中,即得所需的 血浆; 按照每500μL的血浆中加人1mL结合缓冲液(Bindingbuffer)35μL(20μg/μL)蛋白酶K c) 60μL(1μg/μL)carrierRNA比例加人试剂,混匀后于室温放置1min~2min; d) 将上述混合样品于10000×g,4℃离心5min,吸取上清到另一个新1.5mL离心管中,然后加 人10μL微型磁珠,室温,混匀15min~20min; e) 将上一步产物分装到1.5mL离心管中,放于磁力架上,静置1min~2min,吸去废液; f) 加人洗涤缓冲液500μL,混匀后放于磁力架上,静置1min~2min,吸去废液; g) 加人70%乙醇500pL,混匀后放于磁力架上,静置1min~2min,吸去废液; h) 加人40μLTE缓冲液,55℃金属浴10min(每30s混匀一次); 放于磁力架上,静置1min~2min,收集溶液至新的离心管中,即得到循环游离DNA; j) 提取后的循环游离DNA样品应立即开展后续的实时荧光PCR扩增试验。 注:可使用磁珠法或其他等效方法提取循环游离DNA 8.2DNA标准品工作液的配制 取DNA标准物质制备标准品工作液。用非接触式超声波破碎仪将DNA标准物质按超声功率 280W、超声时间5s、间隙时间5s、总工作时间20min的程序片段化为300bp~500bp片段,用一级 水按照表2方法进行梯度稀释。 注1:DNA标准物质片段化程序可根据实际使用的仪器进行调整 注2:超声片段化后,可经过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化范围在300bp~500bp。 表2DNA标准品工作液配制方法 DNA标准品工作浓度 配制方法 XX10"copies/μL 取10μL标准物质母液至90μL水中 X × 10°copies/ μL 取10μLX×10°copies/μL标准品工作液至90μL水中 XX10'copies/μL 取10μLX×10°copies/μL标准品工作液至90μL水中 X×10°copies/μL 取10μLX×10copies/μL标准品工作液至90μL水中 XX10-copies/μL 取10μLX×10°copies/μL标准品工作液至90μL水中 注:X为实际应用的DNA标准物质的赋值,DNA标准品浓度按此进行计算。 8.3实时荧光PCR扩增 8.3.1实时荧光PCR反应体系 本方法采用SYBRGreen法,按表3配制反应体系,各样品配制3个复孔,加样过程先将除DNA模 板以外的各组分预混合,分装到荧光定量PCR反应孔中19uL/孔,最后加入标准品或待测样品1uL 孔,加好后盖紧盖子,短暂离心,立刻进行PCR扩增。 3

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