ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 37746—2019 草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法 Triplex RT-PCR assay for detection of grass carp reoviruses 2020-01-01实施 2019-06-04发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 37746—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：中国水产科学研究院珠江水产研究所。 本标准主要起草人：曾伟伟、王庆、吴淑勤、王英英、石存斌、宋新建、李莹莹、赵长臣。 GB/T37746—2019 引言 本文件的发布机构提请注意如下事实，声明符合本文件时，可能涉及到第7章“操作步骤”和附录B“引 物”与《用于诊断草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测引物组、试剂盒及方法》（专利号：ZL201210039379.8）等 相关专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人：中国水产科学研究院珠江水产研究所 地址：广州市荔湾区西望兴渔路1号珠江水产研究所 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 GB/T377462019 草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了3种不同基因型草鱼呼肠孤病毒的三重RT-PCR检测技术。 本标准适用于对草鱼的3种基因型呼肠孤病毒的核酸进行检测与分离株的鉴定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。e DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonate） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-riboncleosidetriphosphate） EB：溴化乙锭(ethidiumbromide) GCRV：草鱼呼肠孤病毒（grasscarpreovirus） M-MLVRT：莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶（moloneymurineleukemiavirusreversetran scriptase) PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） RNA：核糖核酸(ribonucleicacid) RNaseinhibitor:RNA酶抑制剂 Taq DNApolymerase:Taq DNA聚合酶 三重RT-PCR：三重逆转录-聚合酶链式反应（triplexreversetranscriptasepolymerasechainreac- tion) 4 技术原理 草鱼呼肠孤病毒（GCRV)现有I、IⅡI和Ⅲ型3个基因型，根据同一基因型不同毒株之间共有的保守 序列分别设计特异性引物，这些引物可以特异性扩增相对应基因型分离株的核酸，而不能扩增其他基因 型分离株的核酸。在同一聚合酶链式反应（PCR）反应体系里加入针对3个基因型的3对保守引物，便 可同时扩增出3个大小有差异的核酸片段，可以通过琼脂糖凝胶电泳的电泳条带分子量大小来区分，从 而达到特异性检测和鉴别不同基因型GCRV的目的。 1 GB/T37746—2019 5试剂和材料 5.1水：符合GB/T6682中一级水的规格，核酸抽提和RT-PCR须使用无RNA酶的去离子水。 5.2TRIzolRNA提取试剂或其他商品化的基因组RNA提取试剂盒。 5.3 3氯仿。 5.4异丙醇：-20℃预冷 5.5 5无水乙醇。 5.675%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。 5.7 M-MLV逆转录酶（5U/μL）：-20℃保存。 5.8 dNTPs:含 dCTP,dATP,dGTP、dTTP各10 mmol/μL。 5.9 RNA酶抑制剂(RNasin，40U/μL：一20℃保存。 5.10 TaqDNA聚合酶（5U/μL）：-20℃保存。 5.11 DNA分子量标准DL1000，100bp。 5.12 1.5%琼脂糖凝胶：按附录A中A.1配制。 5.13 50XTAE缓冲液：按A.2配制。 5.14 溴化乙锭（EB,10μg/μL）：按A.3配制。 5.15 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水：按A.4配制。 5.16 PBS（磷酸盐缓冲溶液）：按A.5配制 5.17 引物：逆转录引物按附录B中的B.1,引物浓度为25pmol/μL;PCR引物按B.2,引物浓度为 25pmol/μL。 5.18阳性对照：将3种基因型的GCRV分别接种草鱼性腺细胞（CO)或草鱼吻端成纤维细胞（PSF)， 将获得的病毒液等量混合作为阳性对照。 5.19阴性对照：以CO或PSF细胞液作为阴性对照。 6 器材和设备 6.1PCR扩增仪。 6.2 2高速台式冷冻离心机。 SAG 6.3掌上离心机。 6.4混匀器。 6.5 6.6 5水浴锅。 6.7电泳仪。 6.8电泳槽。 6.9紫外观察灯或（和）凝胶成像系统。 6.10 研钵、剪刀和镊子。 6.11 微量移液器（2.5μL，10μL，100μL，200μL，1000μL）和配套无RNA酶的吸头。 6.12 0.2mLPCR管,l.5mL和0.5mL无RNA酶的Eppendorf管。 2