ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 36861—2018 饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定 分光光度法 Determination of activity of β-mannanase as feed additive- Spectrophotometric method 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36861—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本标准起草单位:浙江大学饲料科学研究所、浙江明珠动物保健品有限公司。 本标准主要起草人:邹晓庭、吴琪、周樱、王小骊、祝春雷、刘国花、谢红云、王凤芹、蒋媛婧、方洛云。 GB/T36861—2018 饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定 分光光度法 1范围 本标准规定了测定饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的分光光度方法。 本标准适用于饲料添加剂β-甘露聚糖酶及其复合酶。本方法的定量限为10U/g。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 β-甘露聚糖酶活力单位β-mannanaseactivityunit 在37℃、pH为5.5的条件下,每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中释放1umol还原糖所 需要的酶量为一个β-甘露聚糖酶活力单位(U)。 4原理 β-甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。还原性寡糖和单糖在沸水浴中与DNS试剂发生 显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中β-甘露 聚糖酶的活力成正比。通过分光光度计比色测定反应液的吸光度,计算出β-甘露聚糖酶的活力。 5试剂或材料 除非另有说明,试剂均为分析纯。 5.1水:符合GB/T6682中二级水的规定。 5.2氢氧化钠溶液(200g/L):称取20.0g氢氧化钠,加水溶解,定容至100mL。 5.3乙酸溶液(0.1mol/L):取冰乙酸0.60mL,加水稀释,定容至100mL。 5.4乙酸钠溶液(0.1mol/L):称取1.36g三水乙酸钠,加水溶解,定容至100mL。 5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.1mol/L,pH5.5):称取23.14g三水乙酸钠,加入1.70mL冰乙酸,再加 水溶解,定容至2000mL。测定溶液的pH,如果pH偏离5.5,用乙酸溶液(5.3)或乙酸钠溶液(5.4)调 节至5.5。 5.63,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:称取3,5-二硝基水杨酸(化学纯)3.15g,加水500mL,45℃水浴 中搅拌5s。然后缓慢加入100mL氢氧化钠溶液(5.2),不断搅拌,直到溶液清澈透明(在加入氢氧化钠 过程中,溶液温度不要超过48℃)。再逐步加人91.00g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚 1 GB/T36861—2018 硫酸钠。继续45℃水浴加热,补加水300mL,不断搅拌,直到完全溶解。冷却至室温后,用水定容至 1000mL。过滤,取滤液,储存在棕色塑料瓶中,避光保存。室温下存放7d后使用,有效期为6个月。 5.7甘露聚糖溶液(6mg/mL):称取0.600g甘露聚糖(SigmaG0753),精确到0.001g,加入80mL 乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5),磁力搅拌,间断性加热,直至甘露聚糖完全溶解,停止加热,继续搅拌 30min,用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)定容至100mL。4℃避光保存,有效期为3d,使用前应搅拌 均匀。 5.8D-甘露糖标准贮备溶液:精确称取预先在105℃干燥至恒重的1.000gD-甘露糖,加乙酸-乙酸钠 缓冲溶液(5.5)溶解,定容至100mL,得到10.0mg/mLD-甘露糖标准贮备溶液。 5.9D甘露糖标准系列溶液:吸取D-甘露糖标准贮备溶液(5.8)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、 5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别置于100mL容量瓶中,用乙酸-乙酸钠缓冲液(5.5)定容,摇匀,配制 成D甘露糖标准工作溶液,浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL0.40mg/mL、0.50mg/mL、 0.60mg/mL.0.70mg/mL 6仪器设备 6.1 分样筛:孔径为0.25mm。 6.2 分析天平:感量0.1 mg。 6.3pH计:精度为士0.01。 6.4 磁力搅拌器:附加热功能。 6.5 恒温水浴锅:37℃。 6.6秒表:每小时误差不超过5s。 6.7 分光光度计:吸光度540nm。 6.87 离心机:离心力不低于为2000g。 7试验步骤 7.1 标准曲线绘制 吸取缓冲液(5.5)4.0mL,加入DNS试剂(5.6)5.0mL,沸水浴加热5min。用水冷却至室温,用水 定容至25mL,制成试剂空白溶液。 分别吸取D甘露糖标准系列溶液(5.9)各2mL,加人至25mL刻度试管中(每个浓度做2个平 行),再分别加人2mL乙酸-乙酸钠缓冲液(5.5)和5mLDNS试剂(5.6),用手微振,沸水浴加热5min, 取出,迅速用水冷却至室温,再用水定容至25mL。以试剂空白溶液调零,在540nm处测定吸光度(A 值)。以D-甘露糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴,绘制标准曲线,获得线性回归方程。 每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。 7.2试样酶液的制备 7.2.1固态样品 固态试样应粉碎或充分碾碎,过0.25mm孔径筛。称取适量试样两份,精确至0.0001g,分别置于 200mL锥形瓶中,加入100mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)。摇床或磁力搅拌提取30min,上离心机 4000r/min离心5min,取上清液,上清液再用缓冲溶液(5.5)做二次稀释,使稀释后的待测酶液中β-甘 露聚糖酶活力控制在0.04U/mL~0.08U/mL之间。 1》SigmaG0753是商品名,来源于角豆树种子的胚乳(槐豆胶),给出这一信息是为了给本标准的使用者一个相对 标准,如果其他产品能有相同的效果,则可使用等效产品 2 GB/T36861—2018 7.2.2液态样品 移取适量试样,用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)进行稀释、定容,稀释后的待测酶液中β-甘露聚糖酶 酸钠溶液(5.4)调整校正至5.5,再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)适当稀释并定容。 7.3测定 7.3.1移取10.0mL待测酶液,置于具塞试管内,37℃士0.2℃水浴10min。 7.3.2称取2g(精确至0.01g)甘露聚糖溶液(5.7),至25mL刻度试管中,37℃±0.2℃水浴10min, 加入5mLDNS试剂(5.6),振摇3s,加人2mL经过37℃士0.2℃平衡的待测酶液,振摇3s, 37℃士0.2℃保温30min,沸水浴加热5min,取出,迅速用水冷却至室温,加水定容至25mL混匀。以 试剂空白溶液调零,用10mm比色血,在540nm处测定样品空白溶液吸光度(A)。 7.3.3称取2g(精确至0.01g)甘露聚糖溶液(5.7),加人到25mL刻度试管中,37℃土0.2℃平衡 10min,加人2mL经过适当稀释的酶液(已经过37℃士0.2℃平衡),振摇3s,37℃士0.2℃精确保温 30min,加入5mLDNS试剂(5.6),振荡混匀,沸水浴加热5min,取出,迅速用水冷却至室温,加水定容 至25mL混匀。以试剂空白溶液为空白对照,在波长540nm下,测定样品管中样液的吸光度(A),通 过线性回归方程计算β-甘露聚糖酶的活力。 8试验数据处理 试样稀释液中β-甘露聚糖酶活力以XD表示,单位为酶活力单位每毫升(U/mL),按式(1)计算: (A-A.)×k+b X1 000 30XM 式中: A 样品管的吸光度; A. 样品空白管的吸光度; k 标准曲线的斜率; b 标准曲线的截距; M D-甘露糖的摩尔质量,单位为克每摩尔(g/mol)(M=180.2g/mol); 30 酶解反应时间,单位为分(min); 1000——单位换算系数。 行分析测定 试样β-甘露聚糖酶的活力以X表示,单位为酶活力单位每克(U/g)或者酶活力单位每毫升 (U/mL),按式(2)计算: SAC X=XDXn .(2) 式中: XD——试样稀释液中β-甘露聚糖酶活力,单位为酶活力单位每毫升(U/mL); 试样的总稀释倍数。 计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下,两次独立测定结果绝对差值不超过其算术平均值的10%。 GB/T36861—2018 7.2.2液态样品 移取适量试样,用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)进行稀释、定容,稀释后的待测酶液中β-甘露聚糖酶 酸钠溶液(5.4)调整校正至5.5,再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)适当稀释并定容。 7.3测定 7.3.1移取10.0mL待测酶液,置于具塞试管内,37℃士0.2℃水浴10min。 7.3.2称取2g(精确至0.01g)甘露聚糖溶液(5.7),至25mL刻度试管中,37℃±0.2℃水浴10min, 加入5mLDNS试剂(5.6),振摇3s,加人2mL经过37℃士0.2℃平衡的待测酶液,振摇3s, 37℃士0.2℃保温30min,沸水浴加热5min,取出,迅速用水冷却至室温,加水定容至25mL混匀。以 试剂空白溶液调零

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