ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T35908—2018 蜜蜂白垩病诊断技术 Diagnostic techniques for chalkbrood of honey bees 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35908—2018 目 次 前言 1 范围 2 规范性引用文件 3 缩略语 试剂和材料 4.1 水 4.2 固定液、染色液和培养基 4.3 PCR检测方法试剂 4.4 引物序列及对照样品 5 仪器设备 临床诊断 6 6.1 流行病学 6.2 箱外观察 6.3 开箱检查 6.4 结果判定 7实验室诊断 7.1 采样 7.2 镜检法 7.3 分离培养 7.4PCR检测 8综合判定 附录A（规范性附录）固定液、染色液和培养基配方· 附录B（规范性附录） PCR检测方法试剂的配方 附录C（资料性附录） 蜜蜂白垩病发病蜂群的巢门前死虫和病虫症状 附录D（资料性附录）蜜蜂白垩病发病蜂群的病脾状态 10 附录E（资料性附录） 蜂球囊菌的光镜下显微图像 11 附录F（资料性附录） 蜂球囊菌PCR产物电泳图 13 附录G（资料性附录） 蜂球囊菌PCR产物参考序列 14 GB/T35908—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫 局、福建农林大学、福建赛福食品检测研究所有限公司。 本标准主要起草人：郑腾、张体银、宋战昀、黄少康、李宋钰、张志灯、陈日春、王武军、白泉阳、 林素洁。 GB/T35908—2018 蜜蜂白垩病诊断技术 1范围 本标准规定了蜜蜂白垩病的诊断技术。 本标准适用于蜜蜂白垩病诊断和病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EB：溴化乙锭（Ethidiumbromide) PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction） SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate) SZIC 4试剂和材料 4.1水 本标准所用水应符合GB/T6682中一级水的规格要求。 4.2 2固定液、染色液和培养基 乳酸苯酚固定液（配方见附录A中的A.1）、乳酸棉蓝染色液（配方见A.2）、病原菌分离培养基（配 方见A,3)。 4.3PCR检测方法试剂 亚精胺-SDS缓冲液（配方见附录B中的B.1)、饱和酚、氯仿、3mol/L的醋酸钠（pH5.5)（配方见B.2)、 TE缓冲液（配方见B.3）、0.5XTBE缓冲液（配方见B.4）、上样缓冲液（配方见B.5）、1.5%琼脂糖凝胶 （配方见B.6）、TagDNA聚合酶（5U/μL）、1oXPCR缓冲液、dNTPMix(1ommol/L） 4.4引物序列及对照样品 上游引物(F):5'-TGT CTG TGC GGC TAG GTG-3'; 蜜蜂蜂球囊菌阳性对照，由指定单位提供或合成含有阳性片段的质粒 蜜蜂蜂球囊菌阴性对照，可以选用健康且无白垩病临床症状的幼虫作为阴性对照， 1 GB/T359082018 5仪器设备 5.1光学显微镜。 5.2恒温培养箱（35℃±1℃）。 5.3A2型二级生物安全柜 5.4冰箱（2℃~8℃和-20℃)。 5.5PCR仪。 5.6电泳仪。 5.7冷冻离心机。 5.8凝胶成像系统。 6临床诊断 6.1流行病学 西方蜜蜂的幼虫易患蜜蜂白垩病，病虫和病菌污染的饲料、蜂具是主要的传染源。菌丝和孢子均具 有侵染性，它们可由成年蜂或蜂螨体表携带并在蜂群内或蜂群间传播。白垩病主要引起老熟幼虫和封 盖幼虫死亡，3日龄～4日龄雄蜂幼虫和4日龄～5日龄工蜂幼虫最易感染白垩病，蜂场内蜂群的发病 病的发生有明显的季节性，多发生在春夏的6月～8月高温、高湿季节。凡是日照长、地势高燥的地方， 严重。 6.2 箱外观察 患病蜂群的巢门口可见被工蜂拖出的幼虫干尸，质硬，有的干尸呈苍白色，似葵花仁状，表面有一层 绒毛膜，开幼虫干户可见内心为浅棕色；有的干尸为部分或全部黑色，似西瓜子状，表面有一层黑色颗 粒状物质。（参见附录C） 6.3开箱检查 从患病蜂群中提出封盖子脾，在已封盖的部分有呈星点式分布被工蜂咬开的巢房，可见内有向一侧 贴壁的幼虫干尸，形态完整，质地柔韧，无光泽，无臭味，用镊子取出后，可见有的为白色，有的为部分或 全部黑色。健康的蜜蜂幼虫是呈有光泽、珍珠样外观。（参见附录D) 6.4结果判定 结合该病的流行特点，若蜂群出现6.1和6.2的典型症状，即可判定为临床诊断阳性。 7实验室诊断 7.1采样 根据临床诊断结果，选择疑似感染的蜂群采集蜜蜂幼虫样品。采样时，应尽量无菌采集变色或死亡 幼虫，样品保存于2℃～8℃的条件下，24h内送实验室检测。 2 SAG GB/T35908—2018 7.2镜检法 7.2.1处理方法 取虫尸样品于无菌培养皿中，用无菌解剖刀刮取样品表面物质置于干净的载玻片上，加1滴～2滴 水或乳酸苯酚固定液，在显微镜下观察，可见呈白色的似棉花般的菌丝或黑色的含有抱子球的抱囊。也 可用乳酸棉蓝染色液进行染色，染色后菌丝呈蓝色（参见附录E）。 7.2.2典型特征 镜检时，蜂球囊菌的子实体为特征性的鉴定部位，墨绿色的孢囊呈球形（参见附录E），自外向内有 3层结构：最外层为墨绿色的闭囊壳，其中包裹着许多球形的子囊，子囊无外膜，子囊中又有大量的椭圆 形的子囊孢子，不同子囊果中子囊的大小和数目也有不同（参见附录E）。待子实体成熟后，子囊壁消 孢囊成熟，子囊壁已不存在，所以显微镜下看见的孢囊内的球形孢子团只是孢子球，每个孢子球的大小 不一，内含的孢子数也不同。成熟的孢囊会自行破裂，释放出孢子（参见附录E）。蜂球囊菌有两个变 种，即大抱球囊霉和蜜蜂球囊霉，其区别在于成熟的滋养细胞和孢囊、抱子大小不同，两变种间彼此不能 杂交。蜜蜂球囊霉的孢囊直径通常为32μm~99μm，平均为65.5μm，孢子（3μm~3.8μm）× （1.5μm~2.3μm）大孢球囊霉的孢囊直径一般为88.4um~168.5μm，平均128.4μm，孢子比前者 天10%。 7.2.3结果判定 根据镜检观察到的典型特征可判为疑似阳性。 7.3分离培养 7.3.1培养方法 无菌操作条件下，将虫样剪成1mm×2mm的小方块，置于75%士5%的乙醇中消毒2min后接种 于病原菌分离培养基平板上，35℃士1℃下培养5d～7d，逐日检查菌丝生长和孢囊产生的情况，待孢 囊产生后挑取孢囊纯化至纯培养。 7.3.2生长特性 在分离培养时，可见蜂球囊菌的菌落呈白色，较致密，中央凸起，菌落老化时颜色变成浅棕色至棕 色。菌丝多呈分支状，二叉分枝间距较大，菌丝体呈疏松的蛛网状。菌丝均匀具横隔膜，直径为 2.5um～6.0um，菌丝细胞多核，雌性菌丝能长出有横隔壁隔离的藏卵器，雄性菌丝能形成体积很小的 呈纺锤形的藏精器，雌雄菌丝相交后几小时内即可形成黑色的孢子带，而同性菌丝相交处则没有黑色的 孢子带，有时两性菌丝混合长成一个菌落，往往成为不规则的黑色孢子带。 7.3.3镜检 分别挑取少量的菌丝和子实体置于载玻片上，加1滴～2滴无菌水或乳酸苯酚固定液，在400倍~～ 600倍的显微镜下观察，可见树枝状分支的有隔菌丝和墨绿色孢囊，孢囊内含有许多大小不等的孢子 球，破裂的孢囊可释放出大量的子囊孢子（参见附录E）。 7.3.4动物感染试验 3 GB/T35908—2018 纯化的蜂球囊菌接种于病原菌分离培养基，35℃土1℃培养5d～7d，待孢囊发育成熟并释放出子囊孢 子时，用水将产生孢囊的菌丝制成菌悬液，菌悬液至少应含有2×10°个孢子/mL。选用无病群健康的 西方蜜蜂幼虫脾，以1日龄～2日龄健康的西方蜜蜂幼虫为试验对象，以水为对照液，分别给健康的幼 虫滴喂菌悬液和对照液，滴喂量为2uL。 蜜蜂幼虫经滴喂菌悬液后，第1天～第3天无异常，感染幼虫与健康幼虫无明显区别：第4天起有 部分感染幼虫出现死亡，随后每天的死亡数量逐日增加；第6天～第7天时死亡量达到高峰；第10天左 右死亡幼虫体壁开始长出白色菌丝，开始呈苍白色，继而发展为暗灰色，继续发展变成僵硬的石灰质块 幼虫发病初期膨胀柔软，腹面出现菌丝，巢房壁上也粘有菌丝。至中期虫体布满菌丝，较初期萎缩 且逐渐硬僵化，形状似粉笔块，部分虫体有黑色子实体覆于体表。病至未期，部分虫体被成年工蜂拖出 封闭。 7.3.5结果判定 依据病原在分离培养过程中的生长特性以及镜检结果进行判定，与7.3.2和7.3.3的结果相符的可 判为阳性，必要时可以进行动物感染试验。 7.4PCR检测 7.4.1病原培养 培养方法同7.3.1。 7.4.2DNA抽提 取0.5g～2.0g纯化好的新鲜或者冷冻的菌丝体放人灭菌研钵中，加人液氮充分研磨，将研磨好的 菌丝粉转移到装有15mL亚精胺-SDS缓冲液的试管中，充分振荡20min后，用等体积的饱和酚进行抽 提，重复抽提1次。取水相用等体积的氯仿进行萃取，再取水相加入1/10水相体积的3moL/L的醋酸 钠（pH5.5）和2倍水相体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀，4℃下1000