ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 35331—2017 番茄亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Didymella lycopersici Klebahn 2018-07-01实施 2017-12-29发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 35331—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国中山出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:崔铁军、罗加凤、陈定虎、刘跃庭、黄国明、杨韶勇。 GB/T35331—2017 番茄亚隔抱壳茎腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了番茄亚隔孢壳茎腐病菌的检疫鉴定方法, 本标准适用于番茄及其他番茄亚隔孢壳茎腐病菌寄主种子、植株、果实中番茄亚隔孢壳茎腐病菌的 检疫鉴定。 2番茄亚隔孢壳茎腐病菌的基本信息 中文名:番茄亚隔孢壳茎腐病菌 学名:Didymella lycopersici Klebahn. 无性世代学名:PhomalycopersiciCooke. 异名:Boeremialycopersici(Cooke)Aveskamp,Gruyter&Verkley. Ascochyta lycopersici (Plowr.)Brunaud. Diplodina lycopersici Hollos. 英文名:ascochyta blight, fruit rot of tomato, leaf spot of tomato, stem canker of tomato, stem rotof tomato 分类地位:番茄亚隔孢壳茎腐病菌属真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),盘菌亚门(Pezizo 双胞腔菌属(Didymella)。无性世代PhomalycopersiciCooke,属腔孢纲(Coelomycetes),球壳孢目 (Sphaeropsidales),茎点霉属(Phoma)。 传播途径:病菌依靠带菌种子及病残体远距离传播。 番茄亚隔孢壳茎腐病菌的其他信息参见附录A。 3方法原理 病原菌为害症状、培养性状、形态特征、致病性测定及代谢产物Antibiotic“E”的测定结果作为番茄 亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定的依据。 4 仪器用具和主要试剂 4.1仪器用具 4.1.1仪器 体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱(一20℃)。 4.1.2用具 培养皿(直径90mm)、白瓷盘、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种针、一次性注射器(1mL)、棉纱、 脱脂棉、酒精灯、离心管(2mL)。 1 GB/T35331—2017 4.2主要试剂 葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、燕麦片、麦芽膏、无水乙醇、1.0%次氯酸钠(NaCIO)、0.1%氢氧化 钠(NaOH)。 马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA、麦芽提取物培养基MEA、燕麦培养基OA,培养基制备方法参 见附录B。 5病菌的鉴定 5.1疑似材料挑选 5.1.1种子中疑似材料挑选 将待检样品倒入洁净白瓷盘内,挑选干瘾、弱小、畸形的可疑病种子和植株残体作为实验材料,植株 残体包括枝、叶、叶柄等。 5.1.2植株疑似材料挑选 取待检植株,仔细观察植株枝、叶、果实上病菌为害症状(参见A.4、图A.1),枝条基部是否有黑褐 有病菌的子实体(分生孢子器),发现病菌子实体的,直接用灭菌的挑针或牙签挑取,制片镜检,显微镜下 观察分生孢子器、分生孢子的形态特征。可疑的枝、叶、果实材料立即进行病菌分离培养。 5.2分离培养 5.2.1实验材料前处理 疑似材料为植株的枝、叶,用自来水充分冲洗,取病健交界组织,剪成约0.4cm×0.4cm小块,用 0.5%的次氯酸钠溶液消毒5min,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干水分后培养;疑似材料为果实,果实病 健交界处组织用75%乙醇擦拭表面消毒,再用灭菌针挑取小块组织进行培养。 种子中挑选出的植株残体和可疑种子分别用纱布包好,放人0.5%的次氯酸钠溶液中,消毒5min, 灭菌水冲洗3次,种子于无菌条件下22℃保湿24h,再置于一20℃下冰冻24h后培养,经表面消毒后 的植株残体,用灭菌滤纸吸干水分后直接培养。 5.2.2病菌分离培养 前处理后的实验材料置马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA平板上,每血放置4粒5粒或4块~~ 5块,18℃~20℃,12h光照黑暗交替培养。培养3d后开始观察,发现乳白色或白色可疑菌落,立即 用PDA、MEA、OA培养基分离纯化,7d后记录菌落培养性状,包括菌落生长速度、颜色,形状等,体视 显微镜下观测分生孢子器产生情况,生物学显微镜下测定分生孢子器、分生孢子形态特征及大小,对菌 落性状及病菌形态特征拍照留存。 5.3致病性测定 灭菌土中种植番茄,幼苗高15cm,约6片~8片叶时接种。待测菌株PDA上培养10d后,取菌落 中分生孢子黏液制成孢子悬浮液(孢子适宜浓度为1X10°CFU/mL),选用健壮番茄幼苗,茎杆用75% 乙醇表面消毒,无菌水冲洗3次,吸干水分,分生孢子悬浮液针刺接种,用湿润脱脂棉覆盖接种部位,以 无菌水接种为对照,接种后放人18℃20℃培养箱内保湿黑暗培养,2d后移去脱脂棉,12h光照黑暗 交替继续保湿培养。 2

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