ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 40980—2021 生化制品中还原糖的测定 柱前衍生高效液相色谱法 Determination of reducing sugar in biochemical products- High-performance liquid chromatography with pre-column derivatization 2022-06-01实施 2021-11-26发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T40980—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 检测有限公司、西华大学、电子科技大学、青岛科技大学、中国测试技术研究院。 吴微、杨杰、王力均、叶德萍、陈凯、张简、张永勤、洪霞、周李华。 1 GB/T409802021 生化制品中还原糖的测定 柱前衍生高效液相色谱法 1范围 本文件规定了采用柱前衍生高效液相色谱法测定生化制品中D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-半乳 糖、L-阿拉伯醛糖、D-木糖、L-岩藻糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-乳糖10种还原糖的测定方法。 本文件适用于含糖胃蛋白酶、静脉注射用人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、改良Y培养基、葡 萄糖肉汤培养基、缓冲动力-硝酸盐、木糖-明胶培养基等生化制品中的甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、阿 拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖含量测定。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 样品中的还原糖经沸水提取，提取液与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)在碱性条件下反应，生成 糖衍生物，经液相色谱分离紫外检测器测定，色谱保留时间定性、外标法定量 C 试剂或材料 除特殊说明外，本方法所用试剂除流动相为色谱纯外均为分析纯，试验用水均为GB/T6682规定 的一级水。 5.1磷酸二氢钾（KH,PO）。 5.2氢氧化钠(NaOH)。 5.3 亚铁氰化钾［K,Fe(CN)。·3H,O]。 5.4 乙酸锌[Zn(CH,COO)2·2H,O]。 5.5 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（CoHioNzO，PMP）。 5.6 盐酸(HCI)。 5.7 三氯甲烷（CHCI，）。 5.8 甲醇(CH,OH)。 5.9 乙腈（CH,CN）：色谱纯。 1 GB/T40980—2021 5.10 三乙胺(C,H1sN)。 5.11 正已烷（C.H.）。 5.12 亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至1000mL。 5.13乙酸锌溶液（220g/L）：称取220.0g乙酸锌，用水稀释至1000mL 5.140.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生溶液：称取87.1gPMP衍生化试剂，加甲醇溶 解并定容至1000mL。 5.151.0mol/LNaOH溶液：称取40.0g氢氧化钠，加人水中溶解并稀释至1000mL 5.161.0mol/LHCl溶液：取83.2mL浓盐酸，缓慢加人约800mL水中，冷却后加水定容 至1000mL。 5.17糖标准品：D-甘露糖（CAS：3458-28-4）、D-核糖（CAS：50-69-1）、L-鼠李糖（CAS：10030-85-0）、D 半乳糖（CAS:59-23-4）L-阿拉伯醛糖（CAS：5328-37-0）、D-木糖（CAS：31178-70-8）、L-岩藻糖（CAS： 2438-80-4）、D-葡萄糖（CAS:50-99-7）、D-麦芽糖（CAS：3458-28-4）D-乳糖（CAS：63-42-3），纯度 均≥99%。 5.18混合标准储备液：分别称取100mg标准物质（精确至0.1mg），用水溶解并定容至100mL，配制 成质量浓度约为1000μg/mL的混合标准储备液，冷藏保存。 5.19标准工作溶液的配制：分别取0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.5mL、1mL、2mL混合标准储备液 定容至10mL容量瓶，配制成5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL 标准溶液浓度系列。 5.20微孔过滤膜：孔径0.45um。 6仪器设备 6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器(UV)或二极管阵列检测器(DAD)。 6.2 分析天平：感量0.01mg和0.0001g。 6.3走 超声波提取器：功率250W，工作频率40kHz。 6.4离心机：最大转速15000r/min。 6.5酸度计：精度为0.01个pH单位，pH值测定范围为014。 6.6数显恒温水浴锅：精确度到0.1℃。 6.7 涡旋混匀器。 6.8 电动粉碎机。 7分析步骤 7.1样品制备 取有代表性的样品至少50g，固体样品（液体样品混匀直接待用）用电动粉碎机粉碎（过孔径为 0.3mm的筛），混匀后装人洁净的盛样容器内，作为试样，室温密封储存。 7.2样品前处理 7.2.1固体样品前处理 取10min；样液冷却后，加人正已烷5mL，涡旋2min，于5000r/min离心5min，弃去正已烷层，将水 层清液倒人50mL容量瓶中；向固体残渣中加入10mL水，涡旋2min，于5000r/min离心3min，水 2