ICS 67.180.10 X 31 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T32946—2016 蜂蜜中脯氨酸的测定 高效液相色谱法 Determination of proline in honeyHigh performance liquid chromatography 2016-08-29发布 2017-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T32946—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华全国供销合作总社提出。 本标准由全国蜂产品标准化工作组归口。 本标准起草单位：中国农业科学院蜜蜂研究所、农业部蜂产品质量监督检验测试中心（北京）、中国 养蜂学会。 本标准主要起草人：李熠、张金振、黄京平、吴杰、吴黎明、赵静、薛晓锋、周金慧、陈芳、干鹏、陈兰珍 I GB/T32946—2016 蜂蜜中脯氨酸的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了蜂蜜中脯氨酸含量的高效液相色谱测定方法。 本标准适用于蜂蜜中脯氨酸含量的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法提要 试样中的脯氨酸用硼酸缓冲液提取后，经柱前衍生，液相色谱荧光检测器检测，外标法定量。 4试剂和材料 4.1 除非另有说明，均使用分析试剂，水为GB/T6682规定的一级水。 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3 乙腈：色谱纯。 4.4 四氢呋喃：色谱纯。 4.5 乙酸钠。 4.6 乙酸。 4.7 硼酸。 4.8 乙二胺四乙酸二钠。 氢氧化钠。 4.9 4.10 磷酸。 4.11 盐酸。 4.12 L-脯氨酸标准品（CAS号：147-85-3）：纯度≥99%。 4.13 4-氟-7-硝基-21,3-苯并氧杂恶二唑（NBD-F，CAS号：29270-56-2）：纯度≥99%。 4.14 氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：称取2.00g氢氧化钠，溶于500mL水中，混匀，转移至聚乙烯瓶中， 密闭放置。 4.15乙酸钠缓冲液（0.1mol/L)：称取13.60g乙酸钠，溶解于1L水中，用乙酸调节pH至7.2，抽滤 脱气。 4.16硼酸缓冲液（0.1mol/L）：称取乙二胺四乙酸二钠0.186g、硼酸3.09g，溶解于500mL水中，氢 氧化钠溶液调pH至8.0。 4.17盐酸溶液（0.1mol/L）：取8.33mL盐酸，定容至1L。 4.18NBD-F溶液（100mmoL/L）：称取NBD-F0.0183g于棕色液相进样瓶中，加人1mL乙腈溶解， 1 GB/T32946—2016 密封保存。 4.19脯氨酸标准储备液（1000mg/L）：准确称取适量脯氨酸标准品，用硼酸缓冲液溶解后，贮存在 4℃冰箱中。 4.20 0.22μm水系滤膜。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配荧光检测器 5.2 分析天平：感量0.01g，0.001g，0.00001g。 涡旋混匀器。 5.4pH计：测量精度±0.02。 恒温水浴锅。 5.6 超声波清洗器。 6 试样的制备与保存 将样品搅拌均匀，分出0.5kg试样置于样品瓶中，密封标记，于4℃下保存。 7分析步骤 7.1提取 称取试样1g，精确至0.001g，置于100mL烧杯中，加人20.0mL硼酸缓冲液，用玻璃棒轻轻搅拌 溶解，超声提取10min。将溶液转移至50mL容量瓶中，用硼酸缓冲液定容至刻度，混匀，0.22μm滤 膜过滤，滤液待衍生化。 7.2衍生化 取200μL样品溶液于棕色液相色谱进样瓶中，再分别加人70μL乙睛、30uLNBD-F溶液，密封， 涡旋混勾，置于60℃恒温水浴避光衍生10min，取出立即放入冰水中冷却，加入100μuL盐酸溶液终止 反应，混匀，待测。 7.3 液相色谱参考条件 液相色谱条件参考以下参数： 色谱柱：C18，5μm，150mmX4.6mm（内径），或相当者； a) b) 流动相：A：0.1mol/L乙酸钠缓冲液-甲醇-四氢喃（900十95+5）；B：甲醇； 柱温：30℃； c) d) 进样量：20μL； e) 荧光检测波长：激发波长470nm，发射波长530nm； f) 梯度洗脱程序见表1。 N