ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 40255—2021 对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程 PCR 检测法 Code of diagnosis for infection with hepatopancreatic parvovirus of penaeid shrimp-PCR method 2021-12-01实施 2021-05-21发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T40255—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本文件主要起草人：杨冰、万晓媛、黄健、余卫忠、史成银、张锋、宋晓玲、李清、张庆利、许华、李晨、 刘莉。 1 GB/T 40255—2021 对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程 PCR检测法 1范围 本文件规定了对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对肝胰腺细 小病毒（Hepatopancreaticparvovirus，HPV），给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试 验步骤和结果判定。 本文件适用于对虾各生活期样品中HPV带毒情况的定性检测，以进行对虾肝胰腺细小病毒病的 流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T28630.4—2012 白斑综合征（WSD）诊断规程 第4部分：组织病理学诊断法 3术语和定义 3 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（basepair） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate) EB：溴化乙锭（ethidiumbromide） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) HCl:盐酸(hydrogen chloride) HPV：肝胰腺细小病毒（hepatopancreaticparvovirus） NaOH：氢氧化钠（sodiumhydroxide） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） SDS：十二烷基硫酸（sodiumdodecyl sulfate) Taq：水生栖热菌（thermusaquaticus） TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTATris·HCI) Tris：三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane） 1 GB/T40255—2021 5试剂或材料 5.1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 5.2 2无水乙醇：分析纯。 5.3TE缓冲液：按A.3配制。 5.4抽提缓冲液：按A.6配制。 5.5蛋白酶K：按A.7配制。 5.6 510mol/L乙酸铵：按A.8配制。 5.7 Tirs饱和酚（pH≥7.8）：分析纯。 5.8 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：分析纯。 5.9 氯仿/异戊醇（24：1）：分析纯。 5.10 1X电泳缓冲液：按A.10配制。 5.11 70%乙醇：按A.11配制。 5.12 dNTPs（各2.5mmol/L)：生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物， 一20℃保存，用于PCR。 5.13 10XPCR缓冲液：生化试剂，无Mg²+离子，一20℃保存 5.14 MgClz（25mmol/L）：生化试剂，一20℃保存。 5.15 TaqDNA聚合酶（5U/μL)：生化试剂，一20℃保存。 5.16引物HPV-F(10μmol/L):5'-GGT-GAT-GTG-GAG-GAG-AGA-3',-20℃保存。 5.17 引物HPV-R(10μmol/L):5-GTA-ACT-ATC-GCC-GCC-AAC-3'，-20℃保存。扩增HPV核 酸中的628bp片段。 5.18内参引物 CF(10 μmol/L):5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3'，-20℃保存。 5.19内参引物 CR(10 μmol/L):5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3'，一20 ℃保存。 扩增十足目生物DNA中的848bp片段 5.20 PCR检测阳性对照为已知受HPV感染且PCR结果显示阳性的对虾组织，一70℃保存。 5.21 PCR检测阴性对照为已知未受HPV感染且PCR结果显示阴性的对虾组织，一70℃保存。 5.22 PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。 5.23 琼脂糖：生化试剂。 5.24 DNA分子量标准：生化试剂 5.25 6×载样缓冲液：生化试剂 5.26 10mg/mLEB贮存液：按A.12配制，或其他等效产品。 6仪器设备 6.1 1PCR仪。 6.2电泳仪。 6.3水平电泳槽。 6.4紫外观察仪或凝胶成像仪。 6.5 5高速离心机。 6.6水浴锅或金属浴。 6.7普通冰箱。 6.8 一80℃超低温冰箱。 2