ICS07.080 CCS C 27 中华人民共和国国家标准 GB/T41906—2022 超氧化物歧化酶活性检测方法 Assay method of superoxide dismutase activity 2022-10-12实施 2022-10-12发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T41906—2022 目 次 前言 引言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 原理 4 5 试剂或材料 仪器设备 样品制备 7 试验步骤 8 结果计算 9 10质量控制 GB/T41906—2022 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由全国工具酶标准化工作组（SAC/SWG11）提出并归口。 本文件起草单位：雷谷（厦门）生物医药有限公司、夏禾（深圳）生物技术有限公司、广东省中鼎检测 技术有限公司、安徽省公众检验研究院有限公司、蚌埠产品质量监督检验研究院、苏州坤琪生物科技有 限公司、深圳市湖大谷奥生物科技有限公司、福建南生科技有限公司、上海鹰姿生命科技有限公司、福建 华灿制药有限公司、山东大学、福建农林大学、复且大学、苏州海狸生物医学工程有限公司、厦门大学、 上海楚豫生物科技有限公司、武汉科技大学、中国计量科学研究院计量与分析科学研究所。 本文件主要起草人：黄发灿、郑登忠、王同珍、童成亮、赵毅、汤庆文、冯翔、刘斌、钟江、朱力、姚鹃、 任辉、张永有、邢志刚、杨忠华、全灿。 GB/T41906—2022 引言 超氧化物歧化酶（EC1.15.1.1，简称SOD)是广泛存在于好氧微生物和动植物中的金属酶，可催化 超氧阴离子自由基发生歧化反应：2O2·-十2H+→H2O2十O2。SOD在维持生物体内超氧阴离子自由 基产生与消除的动态平衡中起重要作用。制定超氧化物歧化酶活性检测方法的国家标准，用以推动该 类工具酶的产业化，对于超氧化物歧化酶的生产和使用具有重要意义 GB/T41906—2022 超氧化物歧化酶活性检测方法 1范围 本文件描述了超氧化物歧化酶活性检测方法的原理、试剂或材料、仪器设备、样品制备、试验步骤、 结果计算和质量控制 本文件适用于超氧化物歧化酶活性的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T6682 2分析实验室用水规格和实验方法 术语和定义 3 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 超氧化物歧化酶superoxidedismutase 广泛存在于好氧微生物和动植物中，可催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的金属酶 注：SOD在维持生物体内超氧阴离子自由基产生与消除的动态平衡中起重要作用。 3.2 超氧化物歧化酶活性单位（U） activity unit of superoxide dismutase 25℃，1mL反应液中每分钟抑制连苯三酚自氧化速率50%时的酶量为一个超氧化物歧化酶活性 单位(U)。 4原理 4个电子生成202-才能进一步生成水。而邻苯三酚自氧化时只接受了一个电子，生成超氧阴离子自由 基，并且在其自氧化过程中以一定的速率产生有色的中间产物。SOD可以将O2歧化分解成HO2和 试剂或材料 除非另有规定，所用的试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水， 5.1A液：0.1moL/L盐酸溶液 量取盐酸4.166mL，加水定容至500mL。 1 GB/T41906—2022 5.2B液：50mmoL/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲液（内含1mmoL/LEDTA·2Na）.pH8.20 称取6.057g的Tris和372.24mgEDTA·2Na溶于500mL水中，搅拌溶解后加人A液229mL， 调pH至8.20，加水定容至1000mL。（Tris溶液可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严）。 5.3C液：10mmoL/L盐酸溶液 量取A液100mL，加水定容至1000mL。 5.4D液：45mmoL/L邻苯三酚盐酸溶液 称取邻苯三酚567.5mg溶于适量C液中并定容至100mL。 6仪器设备 紫外-可见分光光度计、酸度计（精确度0.01pH）、电子分析天平（分度值为0.0001g）、恒温水浴锅。 7样品制备 称取供试品，用合适的溶液配制成1mg/mL的供试品溶液。 8试验步骤 8.1邻苯三酚自氧化速率测定 8.1.1取若干个试管，每管加人B液4.5mL，置恒温水浴锅内25℃保温30min。 8.1.2在光径为1cm的石英比色杯中倒入适量的C液进行校零。 8.1.3取出一个已保温的试管，加人9μL的D液后立即混匀，然后倾倒人石英比色皿中，在325nm波 长处重复测定10次吸光度值，每次测定间隔时间30s 率A（△A/min），计算见公式（1）。 Z(A, -A-2) A 7 式中： A—邻苯三酚自氧化速率，单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； A，——第（i=4,5,6,7,8,9,10)次测量的吸光度值； A/-2——第（i-2)（i=4,5,6,7,8,9,10)次测量的吸光度值。 8.1.5根据测定结果调整D液加样量并重复测定，使自氧化速率A（△A/min)为0.070士0.002。 8.2# 样品液抑制邻苯三酚自氧化速率测定 8.2.1取出一支已完成保温的试管，用微量进样器吸取适量的供试品溶液加人试管中，摇匀。 8.2.2吸取调整后体积的D液加入试管中，立即摇匀并倾倒入石英比色皿中，在325nm波长处重复测 定10次吸光度值，每次测定间隔时间30S。 8.2.3将第一次测定的吸光度数据舍弃，按照公式（2）计算出供试品溶液抑制邻苯三酚自氧化速率A 2 GB/T41906—2022 (△A/min)。 C(AT-A'-2) ...(2) 7 式中： A' 供试品溶液抑制邻苯三酚自氧化速率，单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； A 加入供试品液后第i（i=4，5，6，7，8，9，10）次测量的吸光度值； At-2 加人供试品液后第（i一2）（i=4.5，6，78，9，10）次测量的吸光度值 8.2.4根据测定结果调整供试品溶液的加样量或稀释倍数，使供试品溶液抑制邻苯三酚氧化速率A （△A/min）为0.035±0.002。 9 结果计算 供试品中超氧化物歧化酶的酶活性按公式（3）计算。 A-A' ×100% A N SODu= ..（3) 50% 式中： SODu 超氧化物歧化酶活性，单位为超氧化物歧化酶活性单位每毫升（U/mL）： A 邻苯三酚自氧化速率；单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； A' 供试品溶液抑制邻苯三酚自氧化速率，单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； 4.5 反应液总体积，单位为毫升（mL）； N 供试品溶液稀释倍数； V 加入供试品溶液体积，单位为毫升（mL）。 质量控制 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值 的10%。 GB/T41906—2022 (△A/min)。 C(AT-A'-2) ...(2) 7 式中： A' 供试品溶液抑制邻苯三酚自氧化速率，单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； A 加入供试品液后第i（i=4，5，6，7，8，9，10）次测量的吸光度值； At-2 加人供试品液后第（i一2）（i=4.5，6，78，9，10）次测量的吸光度值 8.2.4根据测定结果调整供试品溶液的加样量或稀释倍数，使供试品溶液抑制邻苯三酚氧化速率A （△A/min）为0.035±0.002。 9 结果计算 供试品中超氧化物歧化酶的酶活性按公式（3）计算。 A-A' ×100% A N SODu= ..（3) 50% 式中： SODu 超氧化物歧化酶活性，单位为超氧化物歧化酶活性单位每毫升（U/mL）： A 邻苯三酚自氧化速率；单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； A' 供试品溶液抑制邻苯三酚自氧化速率，单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； 4.5 反应液总体积，单位为毫升（mL）； N 供试品溶液稀释倍数； V 加入供试品溶液体积，单位为毫升（mL）。 质量控制 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值 的10%。 GB/T41906—2022 (△A/min)。 C(AT-A'-2) ...(2) 7 式中： A' 供试品溶液抑制邻苯三酚自氧化速率，单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； A 加入供试品液后第i（i=4，5，6，7，8，9，10）次测量的吸光度值； At-2 加人供试品液后第（i一2）（i=4.5，6，78，9，10）次测量的吸光度值 8.2.4根据测定结果调整供试品溶液的加样量或稀释倍数，使供试品溶液抑制邻苯三酚氧化速率A （△A/min）为0.035±0.002。 9 结果计算 供试品中超氧化物歧化酶的酶活性按公式（3）计算。 A-A' ×100% A N SODu= ..（3) 50% 式中： SODu 超氧化物歧化酶活性，单位为超氧化物歧化酶活性单位每毫升（U/mL）： A 邻苯三酚自氧化速率；单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； A' 供试品溶液抑制邻苯三酚自氧化速率，单位为吸光度差值每分钟（△A/min）； 4.5 反应液总体积，单位为毫升（mL）； N 供试品溶液稀释倍数； V 加入供试品溶液体积，单位为毫升（mL）。 质量控制 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不大