ICS 65.020.20 B 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 39917—2021 主要农作物品种真实性和纯度SSR分子 标记检测稻 Variety genuineness and purity testing of main crops with SSR markers-Rice 2021-11-01实施 2021-04-30发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 39917—2021 目 次 前言 1 范围 2 规范性引用文件 3术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 3.2 缩略语 总则 4 5 检测方案 5.1 总则 5.2 引物 5.3 检测平台 5.4 样品 5.5 检测条件 6 仪器设备、试剂和溶液配制 6.1 仪器设备 6.2 试剂 6.3 溶液配制 7 真实性检测程序 7.1 引物合成 7.2 DNA提取· 7.3 PCR扩增 7.4 扩增产物分离 10 7.5 数据分析 8 品种纯度检测程序 13 8.1DNA提取 13 8.2 引物筛选和合成 8.3 PCR扩增 14 8.4 扩增产物分离 14 8.5 数据分析 14 9 结果计算与表示 14 9.1 真实性鉴定 14 9.2 纯度测定 14 结果报告 10.1 真实性鉴定 15 10.2 纯度测定 15 1 GB/T 39917—2021 附录A（规范性附录） 溶液配制 16 附录B（资料性附录） 等位基因扩增片段信息 表1 真实性鉴定引物 表2PCR扩增反应体系…. 表3纯度测定候选引物 13 表B.1已知品种主要等位基因扩增片段信息 19 GB/T39917—2021 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37）归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、中国水稻研究所、农业部农作物种子质量监督检验 测试中心（深圳）、中国种子集团有限公司。 本标准主要起草人：徐群、支巨振、魏兴华、刘丰泽、晋芳、邓汉超、董国兴。 GB/T 39917—2021 主要农作物品种真实性和纯度SSR分子 标记检测稻 1范围 本标准规定了稻（OryzasativaL.）品种真实性和品种纯度SSR分子标记的检测原则、检测方案、 检测程序和结果报告。 本标准适用于稻品种真实性验证和真实性身份鉴定，不适用于实质性衍生品种（EDV）和转基因品 种的鉴定。 本标准适用于稻常规种、杂交种及其亲本的品种纯度测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T3543.1农作物种子检验规程总则 GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 品种真实性验证 variety verification 与其对应品种名称的标准样品比较，检测证实供检样品品种名称标注是否名副其实， 3.1.2 品种真实性身份鉴定 varietyidentification 经SSR分子标记检测并通过审定品种SSR指纹数据比对平台（3.1.4）筛查比较，确定供检样品的真 实品种名称。 3.1.3 标准样品 standard sample 国家指定机构保存的经认定代表审定品种特征特性的实物种子样品。 3.1.4 SSR指纹数据比对平台SSRfingerprintblastplatform 网络信息技术所构建的审定品种分子数据信息的检索比对载体。 3.1.5 参照样品 referencecontrolsample 用于校准检测样品SSR等位基因已定义扩增产物片段大小的样品。 1 GB/T39917—2021 3.1.6 引物primer 一条互补结合在模板DNA链上的短单链，能提供3'-OH末端作为DNA合成的起始点，延伸合成 模板DNA的互补链。 3.1.7 组合引物 panel 能够组合在一起电泳的，具有不同颜色或相同颜色而扩增产物片段大小不同的荧光标记的一组 引物。 3.1.8 等位基因allele 在一对同源染色体上同一基因座上的一对基因。 注1：对于SSR检测，等位基因差异以扩增产物片段大小来表示。 注2：对于荧光标记引物，扩增产物片段大小是指一个已定义片段大小的区间范围，本标准将之称为Bin。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:basepair，碱基对。 CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵。 DNA：deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。 dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脱氧核苷三磷酸 PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。 SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基苯磺酸钠。 SSR：simplesequencerepeat，简单序列重复 Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐热DNA聚合酶。 4总则 稻的不同品种，其基因组存在着能够世代稳定遗传的简单序列重复（SSR）的重复次数差异。这种 差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA，用SSR引物进行扩增和电泳，从而通过其扩增 产物片段大小不同而加以区分品种。 依据SSR检测原理，采用固定数目的SSR引物，通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台 比对的方式，对品种真实性进行验证或身份鉴定。真实性验证依据规定数目引物的SSR分子标记差异 数目而判定，品种真实性身份鉴定依据SSR分子标记数目没有差异的原则进行筛查、鉴定而确定。 采用筛选能够准确识别品种异常个体指纹数据或图谱的适宜引物，通过对一定数量检测样品的异 5检测方案 5.1总则 对于真实性鉴定和纯度测定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果准确度、精确度可能有所 不同。应依据“适于检测目的”的原则，统筹考虑检测规模和检测能力，择定适宜的引物、检测平台、样品 状况，制定相应的检测方案 2 GB/T39917—2021 进行检测。 按规定要求填报检测结果，检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息。 5.2引物 5.2.1真实性鉴定 5.2.1.1检测引物数目越多，结果漏检和误判的概率降低，工作量也随之增加，这需要依据检测目的在 体均匀分布等筛选原则，本标准透选了48对作为品种真实性鉴定的检测引物，具体见表1，并据此构建 了已知品种的SSR指纹数据比对平台。表1引物可分为I，Ⅱ两组，编号PRO1～PR24为I组，编号 PR25PR48为II组，每组包含24对。 5.2.1.2品种真实性验证强调的是对结果的否定，相对而言对引物数量要求不高，检测充许采用序贯方 式。先采用I组引物进行检测，若未检测到或检测到可以判定不符结果的差异位点数的，可终止检测。 对于采用组引物进行检测，若检测到而未达到可以判定不符结果的差异位点数的，则继续完成Ⅱ组引 物的检测。 5.2.1.3品种真实性身份鉴定强调的是对结果的背定，在已具备已知审定品种的SSR指纹数据比对平 台的前提下，通过已知检测信息能够筛查确定至具体品种。为尽量降低误判，检测时会对引物数量要求 较高，可采用序贯方式，也可直接采用表1的48对SSR引物进行检测，直至与SSR指纹数据比对平台 比较后能够确定为止。经比较后仍与已知品种存在没有位点差异而无法得出结论的，充许采用其他能 够区分的SSR分子标记进行检测。 5.2.2纯度测定 5.2.2.1纯度测定要明确所检测的异常个体类型，异常个体的类型不同，所选引物和数目也有所不同， 有时还需借助相应父母本的DNA指纹数据。杂交种异常个体主要类型为自交、异交、混杂；常规种和 杂交亲本种子异常个体为异交、混杂。 5.2.2.2品种纯度测定所选的引物，应通过检测样品预试验，筛选出能够准确识别该样品品种的异常个 体。筛选时还需综合考虑引物的杂合度、DNA快速提取和多重组合电泳的潜力。筛选结果表明，样品 在个别位点存在遗传不稳定状况的可将其剔除，检测样品存在严重遗传不稳定状况的可终止纯度测定。 5.3检测平台 5.3.1电泳是检测的关键环节，对于真实性鉴定，可选择采用PAGE电泳、毛细管电泳，但应注意 PAGE电泳检测数据与SSR指纹数据比对平台比对困难，难以进行真实性身份鉴定；对于纯度测定，可 以采用PAGE电泳、毛细管电泳，在选择等位基因扩增片段差异较大的引物前提下也可采用琼脂糖 电泳。 5.3.2对于样品量较大的，可将样品粉碎仪、DNA自动提取和移液工作站、高通量PCR扩增仪、多引物 组合的毛细管电泳进行组合，以提高检测的综合效率。 5.3.3DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求，在适于检测目的和不影响检测质量的前提下，按照 检测平台的要求允许对本标准的规定做适宜的局部改进。 5.4样品 5.4.1真实性鉴定 5.4.1.1送验样品为种子，质量应不低于30g或不少于1000粒。在种子生产基地取样，送验样品可为 3