ICS07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T39100—2020 多肽抗氧化性测定 DPPH 和 ABTS 法 Determination of antioxidant activity for polypeptides- DPPH and ABTS methods 2021-04-01实施 2020-09-29发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T39100—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 北京萨姆伯科技有限公司、武汉明了生物科技有限公司、浙江东杰生物科技有限责任公司、市场监督管 理总局食品审评中心、中国检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：王志新、田益玲、贾英民、马爱进、郝帅、彭海、刘文秋、杨志坚、郑刚、姜雨、 邹明强、孙宇、齐小花 GB/T 39100—2020 多肽抗氧化性测定 DPPH和ABTS法 1范围 本标准规定了DPPH和ABTS法测定多肽抗氧化性能的方法。 本标准适用于多肽体外抗氧化性能的测定。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 多肽polypeptides 介于氨基酸和蛋白质之间，由2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。 3.2 抗氧化能力 antioxidant activity 清除自由基的能力，以待测多肽半数清除量与谷胱甘肽半数清除量的比值（AO值）来表示。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ABTS：2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid)diammonium salt] AO：抗氧化能力（antioxidantactivity） DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) DMSO:二甲基亚砜（dimethylsulfoxide) ECso：半数清除量（halfmaximal effectiveconcentration) C 试剂或材料 除非另有说明，本方法所用的试剂均为分析纯，试验用水为GB/T6682规定的一级水。 5.1 谷胱甘肽 L-还原型，纯度≥98%。 1 GB/T39100—2020 5.2 过硫酸钾 分析纯。 5.3 二甲基亚砜 分析纯。 5.4DPPH溶液 称取DPPH5.0mg，适量无水乙醇溶解，避光超声使其充分溶解，再用无水乙醇定容至100.0mL， 配制成50.0μg/mL的DPPH溶液。该溶液应现配现用。 5.5 ABTS溶液 称取ABTS200.0mg，过硫酸钾34.4mg，溶于50.0mL蒸馏水，摇匀，室温避光放置24h后，作为 ABTS母液。取适量ABTS母液，用95%乙醇稀释至吸光度值在0.70士0.02内（OD734），作为ABTS测 定溶液，该溶液应现配现用。 注：可以根据分光光度计的灵敏度配制合适浓度的ABTS测定溶液。 6仪器设备 6.1分光光度计：波长范围为400nm~800nm，吸光度值精确至0.001。 6.2 2电子天平：感量为0.0001g。 7DPPH·自由基清除法 7.1原理 DPPH是一种暗紫色棱柱状结晶，在无水乙醇溶液中呈深紫色，DPPH·自由基在可见光区517nm处 具有较强吸收峰。该方法通过DPPH提供的1个稳定的DPPH·自由基与抗氧化性多肽提供的1个 电子配对结合，使DPPH·自由基的特征性紫色消失，变为无色或浅黄色，采用紫外可见分光光度计测 定反应后的吸光度。通过与谷胱甘肽的清除能力进行比较，采用相对半数清除量来判定多肽的抗氧化 能力AO值。 7.2试验步骤 7.2.1样品制备 7.2.1.1待测样品溶液 称取多肽样品10.0mg，水溶性好的样品采用蒸馏水溶解与定容，水溶性差的样品先溶于DMSO 再用蒸留水定容，定容至1.0mL，充分混合均匀，配制成10.0mg/mL的母液。用蒸馏水将母液稀释至 不同倍数，得到不同浓度的待测样品溶液。待测样品溶液浓度的选择应使其清除率在35%65%，且 线性方程的R≥0.9500。 7.2.1.2谷胱甘肽溶液 称取L-还原型谷胱甘肽10.0mg，蒸馏水定容至1.0mL，充分混合均匀，配制成10.0mg/mL的母 液。用蒸馏水将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的谷胱甘肽溶液。谷胱甘肽溶液浓度的选择应使 2 GB/T39100—2020 其清除率在35%~65%，且线性方程的R2≥0.9500。 7.2.2测定 7.2.2.1对照组 取3支试管，分别编号为1、2、3号，每支试管中按照表1的组合添加试剂。 表1试剂添加量 1号(A,) 2号(A。) 溶液名称 3号(A,) DPPH溶液 3.0 mL 3.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 谷胱甘肽溶液 样品溶剂溶液 1.0 mL 无水乙醇溶液 3.0 mL 在1号试管中加人3.0mLDPPH溶液和1.0mL谷胱甘肽溶液，作为试验组（A。）；在2号试管中 加入1.0mL谷胱甘肽溶液和3.0mL无水乙醇溶液，作为对照组（A。）；在3号试管中加人3.0mL DPPH溶液和1.0mL样品溶剂溶液，作为空白组（A，）。分别充分混合均匀后，室温避光反应30min， 于波长517nm条件下，用紫外分光光度计测定其吸光度值（样品溶剂调零校准）。 7.2.2.2样品组 用待测样品溶液代替谷胱甘肽溶液，其他操作同7.2.2.1。 7.2.3试验数据处理 按式(1)计算： As X100% .(1) Ak 式中： P 清除率； A.- 待测溶液与DPPH溶液混合液的吸光度； A. 待测溶液与无水乙醇溶液混合液的吸光度； Ab DPPH溶液与样品溶剂溶液混合液的吸光度。 以待测溶液浓度的自然对数值为横坐标，以清除率为纵坐标，建立待测溶液浓度自然对数值与清除 率的线性方程（R²≥0.9500），计算半数清除量EC5，按式（2)计算多肽样品的抗氧化能力AO值 ECso(S) AO: ....(2) EC5o(R) 式中： AO 抗氧化能力； EC5o (S) 多肽样品的半数清除量，单位为毫克每升（mg/L）； ECso(R) 谷胱甘肽的半数清除量，单位为毫克每升（mg/L） 计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留三位有效数字。 ABTS+自由基清除法 8.1原理 ABTS经氧化后生成较稳定的蓝绿色ABTS+自由基，在可见光区734nm处有最大吸收峰，抗氧 GB/T39100—2020 化性多肽与ABTS+自由基反应后使其褪色，在734nm处的吸光值降低，采用紫外可见分光光度计测 定反应后的吸光度。通过与谷胱甘肽的清除能力进行比较，采用相对半数清除量来判定多肽的抗氧化 能力AO值。 8.2试验步骤 8.2.1样品制备 8.2.1.1待测样品溶液 称取多肽样品10.0mg，水溶性好的样品采用蒸馏水溶解与定容，水溶性差的样品先溶于DMSO 再用蒸馏水定容，定容至1.0mL，充分混合均匀，配制成10.0mg/mL的母液。用95%乙醇将母液稀释 线性方程的R≥0.9500。 8.2.1.2谷胱甘肽溶液 称取L-还原型谷胱甘肽10.0mg，蒸馏水定容至1.0mL，充分混合均匀，配制成10.0mg/mL的母 液。用95%乙醇将母液稀释至不同倍数，得到不同浓度的测定溶液。谷胱甘肽溶液浓度的选择应使其 清除率在35%～65%，且线性方程的R²≥0.9500。 8.2.2测定 8.2.2.1对照组 取2支试管，分别编号为1、2号，每支试管中按照表2的组合添加试剂。 表2试剂添加量 1号(A) 溶液名称 2号（A,） ABTS溶液 3.6 mL 3.6 mL 谷胱甘肽溶液 0.4 mL 样品溶剂溶液 0.4 mL 在1号试管中加人3.6mLABTS溶液和0.4mL谷胱甘肽溶液，作为试验组（A）：在2号试管中 加入3.6mLABTS溶液和0.4mL样品溶剂溶液，作为空白组（A，）；分别充分混合均匀后，室温避光反 应5min，于波长734nm条件下，用紫外分光光度计测定其吸光度值（样品溶剂调零校准）。 8.2.2.2 样品组 用待测样品溶液代替谷胱甘肽溶液，其他操作同8.2.2.1。 8.2.3试验数据处理 按式（3）计算： P= X100% ..(3) Ab 式中： P清除率； A，一ABTS溶液与样品溶剂溶液混合液的吸光度； 4 GB/T39100—2020 A。—待测溶液与ABTS溶液混合液的吸光度。 以待测溶液浓度的自然对数值为横坐标，以清除率为纵坐标，建立待测溶液浓度自然对数值与清除 率的线性方程（R≥0.9500），计算半数清除量EC50，按7.2.3中的式（2）计算多肽样品的抗氧化能力 AO值。计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9 重复性 5