ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T35332—2017 葡萄A病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Grapevine virus A 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35332—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、福建省农业科学院、中华人民共和国江苏出人境检验 检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人:张永江、谢丽雪、李彬、魏梅生、李桂芬、马洁、辛言言、张晓雷、吴兴海、朱水芳 GB/T35332—2017 葡萄A病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了葡萄A病毒(GrapevinevirusA)的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带葡萄A病毒的葡萄苗木、接穗、砧木、插条等繁殖材料的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 葡萄A病毒基本信息 3 学名:Grapevine virus A。 缩写:GVA。 异名:葡萄茎痘相关病毒(Grapevinestempitting-associatedvirus) 分类地位:β线形病毒科(Betafleriviridae),葡萄病毒属(Vitiuirus)。 GVA的其他信息参见附录A。 方法原理 4 GVA的蛋白和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据GVA与抗体之间的特异性反应,对植 物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)和免疫电镜检测;依据GVA的基因组特征建 立RT-PCR、实时荧光RT-PCR;通过这些方法的有效组合,判断样品是否带有GVA。 51 仪器、用具及试剂 5.1仪器 冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、PH计、超净工作台、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶 成像分析仪、酶标仪、透射电子显微镜。 5.2用具 酶联板、可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)和可调移液器头、离心管、研 钵、微型磨杆等。 5.3试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA试剂 1 GB/T353322017 SN/T 1840. 6样品制备 将葡萄种苗种植于隔离温室中,在生长期间进行严格的症状检查。对可疑症状的植株,采基部发育 良好具症状的叶片1g单独制样,用于后续检测;无明显症状的,可5株混合采样用于后续检测 7检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照,感染GVA的植物组织作为阳性对照,样品提取缓冲液作 为空白对照;其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致 具体操作见附录B。 7.2免疫电镜检测 免疫电镜检测方法见SN/T1840。 7.3 3RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录C。 7.4实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品 和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录D。如采用商品化 一 步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行。 8结果判定 样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行: 采用DAS-ELISA或免疫电镜方法进行检测,若: 检测结果为阳性时: RT-PCR的检测结果为阳性,则判定样品携带GVA; 或用实时荧光RT-PCR进行检测,若检测结果为阳性,则判定样品携带GVA。 检测结果为阴性时: RT-PCR的检测结果为阴性,则判定样品不携带GVA;检测结果为阳性,则对产物进行测序, 测定的序列为GVA序列,则判定样品携带GVA; 或用实时荧光RT-PCR进行检测,若检测结果为阴性,则判定样品不携带GVA;若检测结果 为阳性,则判定样品携带GVA。 2 GB/T35332—2017 9 样品保存与结果记录 9.1 样品保存 经检测确定携带GVA的样品应保存在适合的条件下以备复核。活体的病株在隔离温室中保存, 其他的离体材料如叶片等样品可保存在一80℃冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少1年。 9.2 2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶 联反应数值;免疫电镜检测应有电镜图片;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有荧 光曲线图。 3

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