ICS 11.220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检测方法 Method of real-time RT-PCR for the detection of the avian influenza virus subtype H7 2004-02-15实施 2004-02-14发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19438.3—2004 前言 GB/I194382004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分: GB/T19438.12004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.2—2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; —GB/T19438.3—2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.4—2004《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A为资料性附录。 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人:高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹 GB/T19438.3—2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检测方法 1 范围 本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分。 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3缩略语 下列缩略语适用于本部分。 3. 1 荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链式反应。 3. 2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3. 3 RNA 核糖核酸。 3. 4 bpL Taq DNA 聚合酶。 3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水。 3.6 DEPC 焦碳酸乙二酯。 4原理 采用TaqMan方法,通过比对离流感病毒血凝素基因,设计一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基 因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其 中5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团(R),3'端标记的TAMRA荧光素(Q)在近距离内能吸收5'端 荧光基团发出的荧光信号,称为灭荧光基团。反应在退火时,引物和探针同时与目的基因片段结合, GB/T19438.3—2004 探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时, Taq酶发挥5'→3'的外切核酸酶功能,将探针降解。这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再 为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应 关系。 5试剂和材料 5.1试剂 除特别说明外,本标准所用试剂均为分析纯,所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器(用DEPC 水处理后高压灭菌)进行分装 5.1.1H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒":试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附 录A。 5.1.2三氯甲烷。 5.1.3异丙醇。 5.1.475%乙醇,用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制。 5.1.50.01mol/L(pH7.2)的PBS:配方见GB/T19438.12004中附录A。121C±2℃,15min 高压灭菌后,无菌条件下按10000IU/mL加入青霉素和链霉素。 5.2仪器设备 5.2.1高速台式冷冻离心机:要求最大离心力在12000r/min以上。 5.2.2荧光PCR仪。 5.2.3计算机。 5.2.42℃~8℃冰箱。 5.2.5一20℃冰箱。 5.2.7混匀器。 5.2.8可移动紫外灯:要求近工作台面。 6样品的采集与前处理 采样过程中样本间不得交叉污染,采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 6.1取样工具 需要下列取样工具: 棉拭子; 剪刀、镊子; Eppendorf 管; 一研钵。 以上取样工具必须经121℃土2℃,15min高压灭菌并烘干。 6.2采样方法 6.2.1活禽样品 取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法为: 对于咽喉拭子,采取时要深入喉头及上颚裂来回刮3次~5次取咽喉分泌液; 取泄殖腔拭子时,将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便; 1)由指定单位提供,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果,则可使用这些等效产品。 2 GB/T19438.3—2004 一将咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放人盛有1.0mLPBS的Eppendorf管中备用。 6.2.2肌肉或脏器样品 用无菌的剪刀、镊子取待检样品2.0g于研钵中充分研磨,加10mLPBS混匀,1000g离心10min 后,取上清液转人Eppendorf管中备用。 6.2.3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至Eppendorf管内备用 6.2.4保存与运送 采集或处理的样本在2℃~8℃条件下保存应不超过24h,长期保存须在一70℃以下,但应避免 反复冻融(冻融不超过三次)。 样品采集后,将采集的样品密封并编号,采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室。 7操作方法 7.1实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C。 7.2样本的制备 7.2.1在样本制备区进行。 7.2.2样本的制备程序: 7.2.2.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和,对每个管编号标记。 换用一个吸头;再加人200μL三氯甲烷,混匀器上剧烈震荡混匀5S。于4℃条件下,12000r/min离 心 15 min。 对每个管编号标记。 7.2.2.4吸取7.2.2.2离心后各管中的上清液转移至已加人异丙醇的相应管中,上清液至少吸取 500uL,不要吸出中间层,颠倒混匀。 转轴方向放置。轻轻倾去上清液,倒置于吸水纸上,沾干液体,不同样品须在吸水纸不同地方沾干。 7.2.2.6加人600L75%乙醇,颠倒洗涤。于4℃条件下,12000r/min离心15min。轻轻倾去上清 液,倒置于吸水纸上,沾干液体。 7.2.2.74000r/min离心10s将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器将其吸干,一份样本换 用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥3min。不宜过于干燥,以免RNA不溶。 7.2.2.8加入11μLDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,冰上保存备用。 提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增,长时间保存,须置于一70℃条件下。 7.3靶核酸的反转录和扩增 7.3.1扩增试剂准备与配制 7.3.1.1、在反应混合物配制区进行。 7.3.1.2从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液、Taq酶,待反应液室温下融化后,2000r/min离心 5s。设所需PCR反应数为n,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反 应体系需使用15uLRT-PCR反应液及0.25uLTa酶。计算各试剂的使用量,加入一试管中,向其中 7.3.2加样 7.3.2.1在样本处理区进行。 3 SAC

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