ICS 11. 220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 17999.5—2008 代替GB/T17999.4—1999 SPF 鸡 微生物学监测 第5部分:SPF鸡 琼脂扩散试验 SPF chicken—Microbiological surveillance- Part 5: Agar gel precipitation test for SPF chicken 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 17999.5—2008 前言 GB/T17999《SPF鸡 微生物学监测》分为10个部分: 第1部分:SPF鸡 微生物学监测总则; 第2部分:SPF鸡 红细胞凝集抑制试验; 第3部分:SPF鸡 血清中和试验; 第4部分:SPF鸡 血清平板凝集试验; 第5部分:SPF鸡 琼脂扩散试验; 第6部分:SPF鸡 酶联免疫吸附试验; 一第7部分:SPF鸡 胚敏感试验; 第8部分:SPF鸡 鸡白痢沙门氏菌检验; 第9部分:SPF鸡 试管凝集试验; 第10部分:SPF鸡 间接免疫荧光试验。 本部分为GB/T17999的第5部分。 关节炎琼脂凝胶免疫扩散试验方法》NY/T556一2002《鸡传染性喉气管炎诊断技术》、OIE《陆生动物 (哺乳动物、禽鸟和蜜蜂)诊断试验和疫苗手册》(第五版)中的有关规定。 本部分代替GB/T17999.4一1999《SPF鸡琼脂扩散试验》。 SAG 本部分与GB/T17999.4—1999相比主要变化如下: 增加了加样示意图、结果判定示意图以示说明; 增加了附录A“马立克氏病病毒抗原琼脂扩散检验的程序”; 增加了附录B试剂的配制”。 本部分的附录A、附录B为规范性附录。 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本部分起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法 斯家禽有限公司。 本部分主要起草人:曲连东、姜骞、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、刘家森、司昌德、郭东春、于海波、 孟庆文。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为: GB/T17999.4—1999。 GB/T17999.5—2008 SPF鸡微生物学监测 第5部分:SPF鸡琼脂扩散试验 1范围 GB/T17999的本部分规定了琼脂扩散试验的技术要求。 本部分适用于对SPF鸡进行以下病原微生物的血清抗体检测:禽流感病毒(AvianInflueza Virus)、传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus)、传染性法氏囊病病毒(InfectiousBursa DiseaseVirus),传染性喉气管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitisVirus)、禽痘病毒(FowlPox Virus)、禽脑脊髓炎病毒(AvianEncephalomyelitisVirus)、网状内皮增生症病毒(Retieuloendotheliosis Virus)、禽呼肠孤病毒(病毒性关节炎)(AvianReovirus)、马立克氏病病毒(Marek'sDiseaseVirus)、禽 腺病毒I群(AvianAdenovirusGroupI)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)。本部分同样适用 于对SPF鸡进行马立克氏病病毒(Marek'sDiseaseVirus)抗原的检测(见附录A)。 2原理 抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中,可以向四周自由扩散,二者互相结合,在最适比例处出现沉 淀线。采用已知抗原检测相应的抗体,或已知抗体鉴定相应的抗原。 3试剂和材料 3.1试剂 3.1.1琼扩抗原或抗体。 3.1.2标准阳性血清。 3.1.3被检血清或羽髓。 3.1.40.01mol/L、pH7.2的8%氯化钠磷酸盐缓冲溶液(见附录B)。 3.1.50.01mol/L、pH6.4的8%氯化钠磷酸盐缓冲溶液(检测禽流感病毒抗体时使用,见附录B)。 3.1.6优质琼脂粉或琼脂糖。 3.2材料 琼扩板,打孔器,移液器。 4操作程序 4.1琼脂板制备 将1g优质琼脂粉或0.8g~1.0g琼脂糖加人100mL的0.01mol/L、pH7.2的8%氯化钠磷酸缓 冲液中(检测禽流感病毒抗体时使用),水浴加热融化,稍凉(60℃~65℃),倒人琼扩板内(厚度为 3mm),待琼脂凝固后,4℃冰箱保存备用 4.2打孔 用打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔,孔径3mm~4mm,孔距3mm。用8号针头挑出孔内 琼脂,挑出时从孔一侧边缘插人针头,轻轻移动,等空气进入孔底后,再向上挑出。 4.3封底 用酒精灯轻烤平皿底部至微融化,以防侧漏 4.4加样 用移液器吸取抗原悬液,滴入中间孔(图1中的①号孔),周围①、①号孔加阳性血清,其余孔加被检 1

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