ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36779—2018 芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Fusarium oxysporum f. sp. api 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36779—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国烟台出人境 检验检疫局。 本标准主要起草人:张卫东、黄永辉、权永兵、宋凤鸣、迟远丽、徐淼锋、廖力、林伟、李金庆、于金迪。 GB/T36779—2018 芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了芹菜枯萎病菌检疫鉴定的方法。 本标准适用于可能携带芹菜枯萎病菌的种子、种苗、植物残体及土壤中芹菜枯萎病菌的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2589植物病原真菌检测规范 3芹菜枯萎病菌基本信息 中文名:芹菜枯菱病菌 学名:Fusarium orysporum Schlecht.f.sp.apii Snyder et Hansen.1940 异名:Fusarium bulbigenum Cooke et Massee.1887,Fusarium orthoceras Appel et Wollenw.1910. Fusariumangustum Sherb.1915,Fusarium orthoceras var.apii(Nelson et Sherb.)Wollenw et Rein- king.1935,Fusarium apii Nelson et Sherb.1937,Fusarium apii var.pallidum Nelson et Sherb.1937, Fusarium orysporum f.apii(Nelson et Sherb.) Snyder et Hansen.194o,Fusarium bulbigenum var. apii(Nelson &Sherb.)Raillo.1950 目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰刀菌属(Fusarium)。 芹菜枯菱病菌的其他信息参见附录A。 4原理 芹菜枯萎病菌的危害症状、菌落的培养性状、寄主范围、分子生物学特性、致病性测定结果等特征是 其鉴定的主要依据。 5仪器设备、用具和主要试剂 5.1仪器 PCR仪、光照培养箱、生物显微镜(100X~1000X)、体视显微镜、组织研磨仪、生物安全柜、高速冷 冻离心机、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、电子天平(感量0.0001g)、pH计、高压灭菌锅 5.2用具 酒精灯、纱布、烧杯、接种针、接种环、培养血皿、锥形瓶、棉花塞、载玻片、盖玻片、铝铂纸、解剖刀、解部 1 GB/T367792018 剪、镊子、记号笔、移液器(1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2.5μL)和离心管。 5.3 主要试剂 无水乙醇、氯化钠、饱和酚、氯仿、次氯酸钠(NaCIO)、异丙醇、异戊醇、五氯硝基苯(PCNB)、冰醋 酸、β-巯基乙醇、Tris-盐酸、Na2EDTA、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、聚乙烯 吡咯烷酮(PVP)、溴化乙锭、DNA分子量标准、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 6现场检疫 取样时应针对性检查,注意检查有无可疑病株,若有可疑病株应将其挑出来,并送实验室进一步检 验鉴定。在以上针对性检查基础上,再按照SN/T2122的规定执行。 7检疫鉴定方法 7.1症状检查 7.1.1种子症状检查 在解剖境下挑选皱缩、干癌、变色、残缺的或有霉变的种子,分成2份,每份种子样品不少于500粒, 其中一份用于PCR初筛,另一份用于病原菌的分离鉴定。 7.1.2植株症状检查 取待检植株,观察植株是否存在生长不良、矮小衰弱、叶柄褪色、叶片变黄等外观变化,纵切叶柄检 查维管束是否变褐褪色(参见附录B),检查植株有无附着土壤。 7.2PCR初筛 7.2.1样品DNA提取 取挑选的种子、植株可疑病变组织或土壤提取DNA(见附录C)。 7.2.2PCR检测 则可报告未检出芹菜枯萎病菌。 7.3病菌分离培养 7.3.1种子 将种子用有效成分为1.25%的次氯酸钠(NaCIO)溶液表面灭菌3min~4min,无菌水洗涤2次,放 25℃光照培养箱里黑暗12h光照12h培养,观察种子上是否出现白色菌丝或霉状物,挑取边缘菌丝移 置PDA培养基平板上纯化。包衣种子可用双蒸水洗去表面的种衣剂。 7.3.2植物组织 取待检样品的组织切成1cm长的小段,冲洗掉表面的泥土杂物后,在75%乙醇中浸泡1min,经无 2 GB/T36779—2018 菌水洗涤后,用灭菌解剖刀横切成长度为2mm~4mm的小方块,放置在垫有3层无菌湿滤纸的培养 Ⅲ中,每血5片~10片,转至25℃光照培养箱里黑暗12h光照12h培养,观察植物残体表面是否出现 白色菌丝或霉状物,挑取边缘菌丝移置PDA培养基平板上纯化。 7.3.3土壤 取2g土壤放人200mL无菌水中,混匀30min,悬浮液稀释10倍,取1mL土壤稀释液涂抹于含 五氯硝基苯(PCNB)的PDA平板上,5个重复,转至25℃光照培养箱里黑暗12h光照12h培养,观察 菌落的产生情况,将可疑菌落转移至PDA培养基平板上纯化。 7.4分离物的纯化 分离物的纯化来用琼胶平板表面单孢子挑取法进行纯化。将分离物上产生的孢子用灭菌水洗下, 稀释到每个培养血中30个左右的抱子,取一定量的抱子悬浮液加到洁净的硬琼胶培养基平板上,25℃ 条件下过夜放置。在生物显微镜下检查,用消毒的解刀或接种针将初萌发单个孢子的小菌块转移到 PDA培养基上。 7.5形态学观察 纯化后的分离物转到PDA上培养,观察记录菌落形态、颜色,大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣 孢子的形态特征;测量菌丝生长速率及分生孢子、厚垣孢子的大小。 7.6病菌分离物的PCR检测 采用CTAB法(见附录C)提取疑似分离物DNA,PCR检测见附录D。 7.7测序 PCR扩增结果为阳性,需将PCR扩增产物进行测序比对,以进一步确证是否为尖孢镰刀菌 7.8致病性试验 将在PDA上培养10d的分离物用100mL无菌水冲洗分生孢子,制成1.0×10个/mL分生孢子 悬浮液,与商业栽培土充分混匀,装人塑料盆中,对照采用清水代替孢子悬浮液接种。将4叶~5叶期 苗龄的健康芹菜苗移植盆中,置于温室(25℃~28℃),每天14h~16h光照,正常淋水管理,接种5周 后检查芹菜植株有无发病,并再次从发病部分离病原菌,观察其形态。 8鉴定特征 8.1培养性状 该病菌在PDA平板上,生长迅速,培养5d后,菌落直径通常4cm~5cm,菌落突起絮状,菌丝由 白色变为淡紫色、淡橙色或米黄色,基物表面淡紫色(参见附录B)。 8.2病原特征 菌丝无色透明,具隔膜,气生菌丝有隔,直径1.5μm~3um。小型分生孢子单胞,无色透明,椭圆形 或卵形,大小4.7um~7.4μm×1.5um~3.7μm;大型分生孢子镰刀形,较稀少,多数为3个隔膜,顶细 胞较尖细,底部具足细胞,大小18.7um~29.6um×3.7μm~4.8um。厚垣孢子间生或顶生,球形,单 个或成对。 3

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