ICS 67.120.99 B 45 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T21166—2007 肠衣中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of nitrofuran metabolites residues in casing- LC-MS/MS method 2007-10-31发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21166—2007 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 本标准主要起草人:陈惠兰、丁涛、沈崇钰、吴斌、徐锦忠、林宏、李公海、张扬、蒋原、蔡宝亮、陶宏锦 GB/T21166—2007 肠衣中硝基喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了肠衣中呋喃它酮的代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(简称AMOZ)、喃西 林的代谢物氨基脲(简称SEM)、呋喃妥因的代谢物1-氨基-2-内酰脲(简称AHD)和呋喃唑酮的代谢物 3-氨基-2-嗯唑烷基酮(简称AOZ)残留量的液相色谱-串联质谱的测定方法。 本标准适用于肠衣中硝基喃类代谢物残留量的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 3方法提要 硝基喃类药物在动物体内迅速分解,其原位稳定性只有数小时,而其代谢物在动物体内容易和蛋 白组织结合,十分稳定。在酸性条件下,与蛋白质组织键合的硝基喃类药物代谢物游离出来,与衍生 化试剂避光衍生化16h,乙酸乙酯提取后,浓缩定容,用液相色谱-串联质谱仪测定,内标法定量。 4试剂和材料 4.1水:应符合GB/T6682规定的一级水。 4.2甲醇:HPLC级。 4.3Z 乙酸乙酯:HPLC级。 4.4 乙酸铵:HPLC级。 4.5无水磷酸氢二钾:分析纯。 4. 6 6二甲基亚砜:分析纯 4.7 邻硝基苯甲醛:分析纯。 4.8盐酸:36%~38%分析纯。 4.9同位素内标:AHD-13C3,AMOZ-D5,AOZ-D4,SEM·HCI-(13C,15N2),100μg/mL,纯度≥98%。 4.10AOZ、SEM·HCI、AMOZ和AHD·HCI标准品:纯度≥98%。 4.11AOZ、SEM、AMOZ和AHD标准储备溶液:1mg/mL。准确称取适量的AOZ、SEM·HCl、 AMOZ和AHD·HCI标准品(4.10).用甲醇(4.2)配成1.0mg/mL的标准储备液。储备液贮存在 4℃冰箱中,1年有效。 4.12AOZ、SEM、AMOZ和AHD标准工作溶液:用甲醇分别配成浓度为100ng/mL、10ng/mL标准 工作溶液,标准工作溶液在4℃保存,3个月有效。 4.13内标溶液:用甲醇配制浓度为50ng/mL四种内标混合溶液,内标混合溶液在4℃保存,1年 有效。 4.14衍生化溶液:50mmol/L邻硝基苯甲醛。称取0.0378g的邻硝基苯甲醛(4.7)到50mL烧杯 1 GB/T211662007 中,加人5mL二甲基亚砜(4.6)溶解,现配。 4.15磷酸氢二钾缓冲液(1mol/L):称取87.1g无水磷酸氢二钾(4.5),加500mL水溶解。 5仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪(串联四极杆):配有电喷雾离子源。 5. 3 旋转蒸发仪或相当者。 5.4水浴振荡器。 5.5 旋涡混匀器。 5.6 贮液器:50mL。 5.7真空泵:真空度应达到80kPa 5.8离心机。 5.9禾 移液器:5mL,200μL。 5. 10 离心管:50mL,具塞。 6试样的制备与保存 6.1试样制备 将实验室样品绞碎均匀,分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品袋中,密封,并做上标记 6.2试样保存 将试样于冷冻状态下保存(一18℃)。 SAG 7测定步骤 7.1提取 准确称取2.00g试样,置于50mL具塞离心管中,准确加入0.100mL50ng/mL四种内标混合溶 液(4.13)、4mL水、0.5mL1mol/LHCl、150μL邻硝基苯甲醛溶液(4.14),于旋涡混匀器上快速混合 30S,37℃水浴振荡过夜(16h)。取出样品,冷却到室温后,加入3.5mL磷酸氢二钾缓冲溶液(4.15), 调节样品溶液pH7~7.5。加人8mL乙酸乙酯,混合30s,2500r/min离心5min,取上层乙酸乙酯溶 液到50mL玻璃试管中,再加人8mL乙酸乙酯,重复上述提取步骤,合并提取液,40℃水浴旋转蒸发 干。用甲醇水溶液(4十6)1.0mL定容,过0.45μm的滤膜到进样瓶中,供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.2标准溶液的衍生化 分别准确移取100ng/mL和10ng/mL四种标准混合溶液(4.12)0.20mL、0.10mL和0.050mL 到相应干净的50mL玻璃离心管中,准确加人0.100mL四种标准内标混合溶液(4.13)、0.5mL1mol/L HCl、150uL邻硝基苯甲醛溶液(4.14),于旋涡混匀器上快速混合30s,37C水浴振荡过夜(16h)。按 照样品提取步骤处理(7.1)后,供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3测定 7.3.1 参考液相色谱条件 色谱柱:Cis,5μm,150mm×2.1mm(内径),或相当者; 流动相:甲醇(A)+0.5mmol/L乙酸铵水溶液(B); c) 流速:0.25mL/min; 梯度洗脱程序:0min~6.0min20%~60%A,6min~8min60%A,8min~9min60%~ 80%A,9min~9.1min80%~20%A,9.1min~10.5min20%A; e) 柱温:室温; f)进样量:25μL。 2 GB/T21166—2007 7.3.2 串联质谱条件 a) 离子源:电喷雾离子化电离源(ESI),正离子监测; b) 扫描方式:选择离子检测(SRM); 雾化气、鞘气为高纯氮气,碰撞气为高纯氨气; c) d) 喷雾电压、碰撞电压等电压值均优化至最佳灵敏度; e) 选择离子对见表1。 表1选择离子对 母离子 子离子 测定物质 (m/z) (m/z) 134.0* AOZ 236.0 104.0 AOZ-D4 240.0 134.0 166.0* SEM 209.0 192.0 212.0 168.0* SEM-(1"C,1'N2) 134 AHD 249.0 178 AHD-13C3 252.0 134a 291a AMOZ 335.0 262 AMOZ-D5 340.0 296.0a 定量离子。 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 衍生化后的标准工作溶液(7.2)在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样,以标准与内标物峰面 积比值为纵坐标,工作溶液浓度(ng/mL)为横坐标,绘制6点标准工作曲线(0.5ng/ml~20ng/mL), 用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中标准的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色 谱条件下,其相应的标准物质、内标色谱图和串联质谱图参见图A.1和图A2。 7.4空白试验 除不加入试样外,按上述步骤进行。 结果计算 结果用色谱数据处理机或按式(1)计算样品中硝基呋喃代谢物的浓度,结果需扣除空白值: Ax·m. Cx= A..m 式中: 样品中硝基呋喃代谢物的浓度,单位为微克每千克(μg/kg); * Ax一一样品中硝基呋喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值; 硝基呋喃代谢物标准的质量,单位为纳克(ng); A. 一标准品中硝基呋喃代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值; 样品质量,单位为克(g)。 m- 3

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