ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21105—2007 动物源性饲料中狗源性成分定性 检测方法 PCR方法 Identification of Canis derived materials in animal-originated feedstuffs-PCR method 2007-10-24发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T21105—2007 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人:高宏伟、梁成珠、干岩、干立新、徐宝梁、陈颖、吴亚君、宗卉、温燕辉、曹际, 本标准首次发布。 1 GB/T21105—2007 动物源性饲料中狗源性成分定性 检测方法PCR方法 1范围 本标准规定了动物源性饲料中狗(Canis)源性成分检测的PCR方法,该检测方法的检出限为 0.1%. 本标准适用于动物源性饲料中狗源性成分的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT) SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction;PCR 用于扩增位于两段已知序列之间DNA(deoxyribonucleosideaacid,脱氧核糖核酸)的方法。模板 别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP(de- oxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷酸三磷酸)为底物,使退火引物得以延伸,如此反复变性、退火 和DNA合成这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增,经25个~30个扩增 循环,扩增倍数达到约10°。 4原理 利用裂解液破碎细胞,三氯甲烷抽提蛋白质,异丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行 5试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB6682的要求 5.1狗源性成分检测用引物(对)序列为: canis F:5'-TCCAGGTAAACCCTTCTT-3' canis R:5'-TACGAGCAAGGGTTGATGG-3" 5.2TaqDNA聚合酶(Taq,Thermusaquaticu,水生栖热菌)。 5.3限制性内切酶:HphI酶。 5.4dNTPs:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,脱氧腺苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphos 1 GB/T21105—2007 phate,脱氧胸苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸)。 5.5琼脂糖:电泳纯。 5.6溴化乙锭。 5.7三氯甲烷。 5.8异丙醇。 5.970%乙醇。 5.10分子量标准品(100bp2000bp)(bp:basepair,碱基对)。 5.11裂解液:1%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵),0.05mol/LTris- HCl(pH8.0)[Tris-:tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羟甲基)氨基甲烷],0.7mol/LNaCl, 0.0lmol/LEDTA(pH8.0)(ethylenediaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸)。 5.12TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液):10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA (pH8. 0) . 5.1310XPCR缓冲液:100mmol/LKCl,160mmol/L(NH,),SO4,20mmol/LMgSO4,200mmol/L Tris-HCl(pH8,8),1%TritonX-1oo(t-octylphenoxypolyethoxyethanol,辛基苯氧基聚乙氧乙醇), 1mg/mLBSA(bovineserumalbumin,牛血清蛋白)。 5.14电泳缓冲液:Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/LTE缓冲液(pH8.0)20mL,加蒸馏水至1000mL; 使用时10倍稀释。 5.15溴化乙锭贮存液:用水配制成10mg/mL。 5.16加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,40%(质量浓度)蔗糖水溶液。 5.17 酶切缓冲液:10mmol/L Tris-HCl (pH7.5),10mmol/LMgCl²,50mmol/LNaCl,0.1mg/mLBSA。 6仪器设备 6.1DNA热循环仪。 6. 2 2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.3恒温水浴锅。 6.4 离心机:离心力12000g。 6.5 微量移液器。 6.6电泳仪。 6.7 紫外检测仪。 6. 8 pH计。 6.9 天平:感量0.01g。 7试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样,将实验室样品粉碎,充分混合均匀后待用。 8检验步骤 8.1样品的总DNA提取 称取适量饲料(饲料粒度为100目称取50mg60目称取100mg;20目称取200mg)于1.5mL离 心管中,加人600μL~800μL裂解液,65℃30min,期间不时振荡混匀;12000g离心5min;转移上清 于洁净离心管中,加400μL三氯甲烷+异戊醇(24+1),混勾;12000g离心5min,取上清液;加0.8倍 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 2 GB/T21105—2007 8.2DNA浓度和纯度的测定 取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式(1)计算: c=AXNX50/1000 ...(1) 式中: c——DNA浓度,单位为微克每微升(μg/μL); A—260nm处的吸光值; N——核酸稀释倍数。 当A260/A280比值在1.7~1.9之间时,适宜于PCR扩增。 8.3PCR扩增 25μL的反应体系,在0.2mL的PCR反应管中,引物canisF和canisR各200nmol/L,10×PCR (100ng士50ngDNA)。设立阳性对照、阴性对照、空白对照组。 PCR反应条件随仪器不同略有改变,一般的反应程序为:94℃预变性3min。94℃变性45s,56℃ 退火45s72℃延伸45s,35个循环。72℃延伸5min。4℃保存。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含狗源性成分的样品作阳性对照,用已 知不含狗源性成分的样品作阴性对照,用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。 8.4PCR扩增产物电泳检测 取2g琼脂糖,于100mL电泳缓冲液中加热,充分熔化,加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL, 制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。将5μL~8μLPCR扩增产物分别和适量 加样缓冲液混合,点样。9V/cm恒压电泳,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电 泳结果并记录。 8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测 如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性,进行限制性内切酶酶切反应。 反应体系(20μL):HphI酶2U,酶切缓冲液2μL,加PCR扩增产物至总体积20μL。 酶切在37℃下进行,20min。酶切完成后电泳,方法见8.4。 9结果判断与表述 9.1PCR扩增产物电泳检测结果 阳性样品的PCR扩增产物大小为213bp(序列参考附录A)。 9.2限制性内切酶酶切结果 阳性样品PCR产物采用内切酶HphI酶切后,酶切片段大小为179bp和34bp。 9.3结果表述 PCR产物为阴性者判为不含有狗源性成分,表述为未检出狗源性成分。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193执行。 11 废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理。

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