ICS 65.020.30 B 40 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T25170—2010 畜禽基因组BAC文库构建与 保存技术规程 Technical regulation of farm animals genome BAC library construction and preservation 2010-09-26发布 2011-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T25170—2010 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。 本标准起草单位:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 本标准主要起草人:关伟军、马月辉、刘长青、潘春留、刘洪坤、甫亚斌、余露露。 1 GB/T25170—2010 畜禽基因组BAC文库构建与 保存技术规程 1范围 本标准规定了畜禽基因组BAC文库构建方法。 本标准适用于猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅等畜禽的基因组BAC文库构建与保存 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 基因组文库 genome library 用重组DNA技术将某种生物细胞的核DNA的全部片段随机地连接到载体上,冉转移至适当的宿 主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集 3.2 细菌人工染色体bacterialartificialchromosome,BAC 以大肠杆菌致育因子为基础,利用现代重组DNA技术体外人工合成的具有容纳高分子量外源 DNA的特性载体。 3.3 DNA连接DNAligation 键的过程。 3. 4 感受态细胞competentcells 在特定条件下细胞膜通透性发生改变,允许外源DNA进人细胞内的特殊状态下的受体细胞 3.5 电转化electrotransformation 在高压脉冲的作用下,将外源DNA导人感受态细胞的过程。 3. 6 脉冲场凝胶电泳 Kpulsefieldgel electrophoresis,PFGE 3.7 重组体 recombinant 两种以上不同来源的DNA片段连接所形成的杂种DNA分子。 1 GB/T25170—2010 4试剂及溶液配制 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水要符合GB/T6682中一级水的要求。 4.1LB培养冻存缓冲液(luria-bertanimedia) 360mmol/LK,HPO4,13.2mmol/LKH,PO,1.7mmol/L柠檬酸钠,0.4mmol/LMgSO4 6.8mmol/L(NH,),SO,4.4%甘油,定容至100mL,应用时以冻存缓冲液与LB液体培养基1:9的 比例配制。 4.25-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷贮存液(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside,X-gal) 用二甲基甲酰胺溶解X-gal,配成20mg/mL贮存液,一20℃避光保存。 4. 31 mol/L Tris-CI 121.10g/LTris碱溶于800mL/L双蒸水(doubledistilledH,O,ddH,O)中,用HCl调pH至 8.0,定容至1000mL,高压灭菌。 4.4内切酶缓冲液 10mg/mLBSA,1o×酶反应缓冲液,1mmol/LDTT,1mmol/L亚精胺。 4.5SOC培养基 称取20.00g胰化蛋白陈,5.00g酵母提取物,0.50gNaCl量取2.5mL1mol/LKCl,10ml 葡萄糖溶液。 4.6异丙基硫代-β-D-半乳糖苷溶液(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG) 称取1.00gIPTG溶于5.0mL双蒸水中,过滤除菌装成1mL/份,贴存于一20℃C。 4.7琼脂糖块储存液 800mLddHO中加人186.10g乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA),在 磁力搅拌器上搅拌,调pH至8.0后,加ddHO定容至1000mL,高压灭菌。 4.8CsCI密度梯度离心纯化液 3.3mL饱和CsCl,加灭菌石蜡油至总体积10mL。 4.9十二烷基肌氨酸钠缓冲液(N-Dodecanoyl-N-methylglycine sodiumsalt,NDS) 称取186.00gEDTA和1.20gTris-Cl,溶于700mLddH,O中,调pH至8.0,加入NDS调pH 至9.5,用ddH,0定容至1L,过滤灭菌。 4.10抗凝剂(柠檬酸钠葡萄糖液) 称取0.48g柠檬酸、1.32g柠檬酸钠、1.47g葡萄糖,用ddHz0定容至100mL,高压灭菌。 4.11氯霉素 乙醇配制,工作浓度为12.5μg/mL,一20℃保存。 4.12Tris(10mmol/LpH8.0)-EDTA(1.0mmol/LpH8.0)缓冲液,TE 10mmol/LpH8.0Tris-Cl,1.0mmol/LpH8.0EDTA,高压灭菌,室温保存。 4.13LB液体培养基 称取10.00g细菌培养用胰蛋白陈、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00gNaCl溶于800ml ddHO中,调pH至7.4,定容至1L,高压灭菌。 4.14LB固体培养基 称取10.00g细菌培养用胰蛋白陈、5.00g细菌培养用酵母提取物、10.00gNaCl,溶于800mL ddH,O中,调pH至7.4,加人15.00g细胞培养用琼脂,定容至1L,高压灭菌。 4.15含特定抗生素培养基 按照4.14的方法配制好LB固体培养基,高压灭菌后待其不烫手时,按2mL培养基:1L氯霉 素(12.5μg/mL)的比例添加氯霉素,倒20mL培养基于90mm培养板中。待培养基凝固后,将40μL 2 SZG GB/T25170—2010 X-gal和7μuLIPTG混匀后,均匀涂于培养基表面,超净台里晾干备用。 4.16碱裂解液I 50mmol/L葡萄糖,25mmol/LpH8.0Tris-Cl,10mmol/LpH8.0EDTA,定容至1L,高压灭菌, 4℃保存。 4.17碱裂解液Ⅱ 0.2 mol/L NaOH,1% SDS,现用现配。 4.18碱裂解液Ⅲ 1.32mol/L乙酸甲,4℃保存。 5主要仪器、设备 水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱、培养箱、电子天平、一80℃低温冰箱、超纯水仪、低温离心机、凝胶 自动成像分析系统和脉冲电泳仪等。 6基因组BAC文库构建 6.1高分子量DNA制备 6.1.1细胞收集 6.1.1.1家禽血细胞的收集 采集3.0mL~5.0mL畜禽新鲜血液,立即注人含1mL肝素钠(500U/mL)或柠檬酸钠葡萄糖的 离心管中抗凝。4℃下,4500g离心5min,弃上清,加入等体积预冷的pH7.0磷酸盐缓冲液 (phosphatebufferedsaline,PBS),混匀。上述血细胞收集步骤重复离心3次后,加人1.0mLPBS重悬 细胞。重悬细胞后计数,将血细胞密度稀释到1.0X10°个/mL~2.5X108个/mL。 6.1.1.2家畜血细胞的收集 采集10mL~20mL家畜新鲜血液,加入等体积红细胞裂解液,37℃下放置1h,4℃下,583g离心 5min,其余步骤同6.1.1.1。 6.1.1.3畜禽其他组织细胞收集 在干冰或液氮存在的条件下,将新鲜的畜禽组织碾成粉未,悬浮在PBS中,振荡混匀,用两层纱布 过滤。其余步骤同6.1.1.1。 6.1.2细胞裂解 取细胞密度为1.0×10°个/mL~2.5×108个/mL的悬液和1%低熔点琼脂糖在45℃下放置5min 30min形成凝胶块。将凝胶块置于含有0.1mg/mL蛋白酶K和30mL1%NDS缓冲液中50℃下水浴 3h后更换相同缓冲液,再50℃水浴24h~28h。用30mLTE缓冲液(pH7.6)在30min内洗涤3次(冰 上操作)以去除TE缓冲液,置于1.0mmol/L苯甲基磺氟(phenylmethylsulfonylfluoride,PMSF)中, 50℃下水浴30min,中间换液一次。将凝胶块储存于0.5mol/LEDTA(pH8.0)中4℃可保存半年。 6. 1. 3基因组 DNA 酶切与回收 将凝胶块在4℃下用30mLTE缓冲液浸泡3h~4h中间换液3次4次。置于1mL的适宜限 制性内切酶缓冲液中,冰浴1h,中间换液1次。分别移至不同酶量(1U~20U)的酶切缓冲液中,冰上 渗透1h后,37℃下酶切10min~30min,用1/10体积0.5mol/LEDTA(pH8.0)终止反应。将不完 全消化的DNA凝胶块在0.5XTBE中,13℃,180V~120V.120角,脉冲时间60s~10s条件下进行 PFGE电泳,电泳时间16h~24h。 6.1.4最适DNA片段获得 6.1.4.1第一次电泳选择 用1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切获得的大分子量DNA,电泳条件同6.1.3,电泳时间24h。电泳结 3

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