ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 23741—2009 饲料中4种巴比妥类药物的测定 Determination of four kinds of barbiturates in feeds 2009-09-01实施 2009-05-12发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 23741—2009 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本标准主要起草单位:农业部饲料质量监督检验测试中心(济南) 本标准主要起草人:李俊玲、李会荣、强莉、刘继明、门晓冬、李宏、杨志强 GB/T23741—2009 饲料中4种巴比要类药物的测定 1范围 本标准规定了饲料中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的高效液相色谱测定方法和液相 色谱-串联质谱测定法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中4种巴比妥类药物的测定。高效液相色 谱测定方法定量限为1mg/kg,液相色谱-串联质谱方法定量限为0.05mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696:1987,MOD) GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1—2005,ISO64972002,IDT) GB/T20195动物饲料试样的制备(GB/T20195—2006ISO6498:1998IDT) 3方法原理 蒸干后用甲醇水溶解,在高效液相色谱仪上分离、测定,或在高效液相色谱-串联质谱仪上测定,外标法 定量。 4试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂,实验室用水符合GB/T6682一级水的规定。 4.1甲醇:色谱纯。 4.2乙睛:色谱纯。 4.3 三氯甲烷。 4.4二氯甲烷。 4.52%甲醇水溶液:取2mL甲醇与98mL水混合。 4.6甲醇水溶液:1+1。 4.7 乙腈水溶液:30十70。 4.8磷酸盐缓冲液:c(NazHPO+NaH,PO,·2H,O)=0.1mmol/L,pH=6.0。称取14.2g的无水 磷酸氢二钠(Na2HPO),加水定容至1000mL,摇匀;另称取15.6g的磷酸二氢钠(NaH,PO: 2H,0),加水定容至1000mL,摇匀。取上述两种溶液按123十877的比例混匀即可。 4.9流动相:甲醇十水=45十55。 4.10巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品:纯度≥99.0%。 4.11标准贮备液:准确称取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品各25mg,分别用甲醇 (4.1)溶解,定容至25mL,配成浓度为1mg/ml的标准贮备液。2℃~8℃冷藏保存,有效期三个月。 4.12混合标准中间液:准确移取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比要和司可巴比妥要贮备液(4.11)各5mL, 用甲醇(4.1)定容至50mL,该混合溶液中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的浓度均为 100μg/mL。2℃~8℃冷藏保存,有效期一个月。 1 GB/T23741—2009 4.13固相萃取小柱:亲水亲脂平衡固相萃取柱,3mL(60mg)。 4.14 滤膜:0.22μm。 4.15滤纸:快速,12.5cm 5仪器和设备 5.17 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.2 液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源。 5.3天平:感量为0.0001g。 5.4氮吹仪。 5.5涡旋振荡器。 5.6固相萃取仪。 6试样制备 按GB/T14699.1采样。选取有代表性饲料样品至少500g,按GB/T20195规定,制备通过 0.45mm实验筛的试样。 7试样处理 7.1提取 称取试料2g(精确至0.0001g)于100mL离心管中,准确加入25mL三氯甲烷(4.3),涡旋振荡 2min,过滤。准确移取滤液15mL于具塞试管中,40℃氮吹至干,加人磷酸盐缓冲液(4.8)3mL,涡旋 溶解,备用。 7.2净化 固相萃取小柱分别用5mL甲醇(4.1)、5mL水、5mL磷酸盐缓冲液(4.8)活化。取上述提取液 (7.1)过柱,再分别用5mL磷酸盐缓冲液(4.8)、5mL甲醇水溶液(4.5)淋洗,空气抽干30min,用 10mL二氯甲烷(4.4)洗脱,收集洗脱液,40℃氮吹至干,准确移取1mL甲醇水溶液(4.6)溶解残渣, 过0.22μm滤膜后待测。 8液相色谱测定 8.1液相色谱条件 色谱柱:Cg柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或其他效果等同的Cg柱。 柱温:室温。 进样量:20μL。 流动相:甲醇十水=45十55。 检测器:紫外检测器或二极管阵列检测器 检测波长:215nm。 流速:1.0mL/min。 8.2标准曲线的绘制 取混合标准中间液(4.12)适量逐步稀释,用甲醇(4.1)定容,配制成浓度分别为0.5μg/mL、 1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的混合标准工作液,浓度由低到高进 样,根据峰面积和浓度计算回归方程。4种巴比妥类药物液相色谱条件下标准样品图谱参见图A.1。 8.3定量测定 试料溶液(7.2)上机测定,用单点或多点校准法进行定量。多点校准法定量,根据峰面积的响应值, 从标准曲线中得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(ci);单点定量,根据样品峰面积的响应值与标准 2 GB/T 23741—2009 溶液峰面积的响应值比值与标准溶液浓度的乘积得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(cir)。 8.4结果计算 试料中4种巴比妥类药物的含量X,以质量分数计,单位为毫克每千克(mg/kg),按式(1)计算: mXVx1000 式中: 试料中某种巴比妥药物色谱峰面积对应的浓度,单位为微克每毫升(ug/mL); V 加人提取液的总体积,单位为毫升(mL); V2—一氮吹至干后溶解残渣用甲醇水溶液的体积,单位为毫升(mL); m—试料的质量,单位为克(g); 一移取滤液的体积,单位为毫升(mL) Vi- 计算结果保留三位有效数字。 8.5重复性 在同一实验室、由同一操作人员完成的两个平行测定结果,相对偏差不大于10%,以两次平行测定 结果的算术平均值为测定结果。 液相色谱-串联质谱法(仲裁法) 9 9.1液相色谱条件 色谱柱:Cis柱长100mm,内径2.1mm,粒径1.7μm,或其他效果等同的Cis柱; 柱温:40℃; 进样量:5uL; 流动相:乙睛十水,梯度洗脱,见表1; 表1液相色谱-串联质谱流动相梯度洗脱表 时间/min 水/% 乙腈/% 0. 0 70 30 0.5 70 30 1.0 50 50 4.0 20 80 4. 01 70 30 10.0 70 30 流速:0.4mL/min。 9.2质谱条件 离子源:电喷雾离子源; 扫描方式:负离子扫描; 检测方式:多反应监测(MRM); 毛细管电压:4.0kV; 干燥气温度:350℃; 干燥气流速:10L/min; 雾化气压力:0.241MPa(35psi); 定性离子、定量离子及对应的保留时间、毛细管出口端电压和碰撞能量见表2。 3

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